壯藥排錢(qián)草總生物堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原和細(xì)胞因子生成的影響△

陳少鋒 趙湘培 余勝民

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001)

壯藥排錢(qián)草總生物堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原和細(xì)胞因子生成的影響△

陳少鋒 趙湘培 余勝民

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001)

目的：研究排錢(qián)草總生物堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)相關(guān)膠原和細(xì)胞因子的分泌影響。方法：體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，將排錢(qián)草總生物堿(終濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL)作用于細(xì)胞48h后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，根據(jù)IC50選取無(wú)細(xì)胞度濃度進(jìn)一步研究；收集細(xì)胞上清液，用ELISA法分別檢測(cè)Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(COL-Ⅲ)、Ⅳ型膠原(COL-Ⅳ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF)的含量。結(jié)果：排錢(qián)草總生物堿能明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，其抑制作用與藥物終濃度呈量效關(guān)系，求得IC50為337μg/mL；并顯著降低HSC-T6 細(xì)胞生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1，PDGF含量，與空白對(duì)照組比較，P<0.05或P<0.01。結(jié)論： 排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，并能降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF的含量。

排錢(qián)草總生物堿；HSC-T6；細(xì)胞因子

排錢(qián)草是廣西、廣東等地廣泛應(yīng)用的民間藥材，是豆科植物排錢(qián)草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。由于其具有清熱利濕、活血祛瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、除濕消腫等功效，因此常用于治療肝炎、子宮脫垂、肝脾腫大、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)等癥[1]。在針對(duì)肝纖維化的治療中，前期已有藥理研究證實(shí)排錢(qián)草有顯著活性[2-6]，但均未對(duì)其抗纖維化機(jī)制深入研究，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從細(xì)胞分子學(xué)水平研究排錢(qián)草總生物堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞膠原合成及細(xì)胞因子的分泌的影響，為進(jìn)一步研究其抗肝纖維化作用機(jī)制提供前期理論依據(jù)，對(duì)開(kāi)發(fā)排錢(qián)草這一民族藥資源具有重要意義。

1 材料

1.1 藥物：排錢(qián)草，采自廣西恭城瑤族自治縣，經(jīng)作者本人鑒定為豆科植物排錢(qián)草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。

排錢(qián)草總生物堿：取排錢(qián)草粗粉加70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，醇提液過(guò)濾，濾液回收乙醇至稠膏狀，加1%鹽酸溶解，過(guò)濾，濾液用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液棄去，酸水液用氨水調(diào)PH9后用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液回收三氯甲烷至稠膏狀，得總生物堿，以蒸餾水配成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司,批號(hào)：AAM210569)；胎牛血清(HyClone,批號(hào)：NVJ0313)；胰蛋白酶(Solarbio,批號(hào)：201611)；雙抗(gibco公司,批號(hào)：15140-122)；四氮唑藍(lán)MTT(Solarbio,批號(hào)：410C05)；COL-ⅠELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號(hào)：201611)、COL-Ⅲ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號(hào)：201611)、COL-Ⅳ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號(hào)：201611)、TGF-β1 ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號(hào)：201611)、PDGF ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號(hào)：201611)。

1.3 儀器：倒置顯微鏡(LEICA DMIRB)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo)；超凈工作臺(tái)(荷蘭ClearAir公司)；離心機(jī)(德國(guó)Biofuge Stoctos 公司)；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，ST360)1.4細(xì)胞：HSC-T6細(xì)胞株由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供。

2 方法[7]

2.1 排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HSC-T6 細(xì)胞，用0.25% 胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成3×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板板中，每孔100ul。細(xì)胞設(shè)空白對(duì)照組、6個(gè)不同濃度排錢(qián)草總生物堿組(終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、μg/mL)，每組4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞接種后，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h后，各組加入對(duì)應(yīng)的藥物濃度，空白對(duì)照組只加含DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，按照MTT法，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)每A值。測(cè)得的各復(fù)孔A值取平均值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)抑制率求出IC50,根君IC50選取3個(gè)無(wú)細(xì)胞毒作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 抑制率=(1-藥物A/對(duì)照A)×100%

2.2 排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HSC-T6 細(xì)胞，用0.25% 胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成3×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板板中，每孔100ul。細(xì)胞設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(秋水仙堿,終濃度為1μg/mL)、及3個(gè)不同濃度排錢(qián)草總生物堿組(終濃度為150、75、37.5μg/mL)，每組 4 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種后于在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，藥物組加入對(duì)應(yīng)的藥物濃度，空白對(duì)照組只加含DMEM 完全培養(yǎng)液，體積均為100ul，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清液3000 r·min 離心10 min，取上清液，按ELISA 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以()表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響：由表1提示，排錢(qián)草總生物堿16.625～500μg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且呈劑量關(guān)系，求出排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6細(xì)胞半數(shù)抑制濃度IC50為337μg/mL。

表1 排錢(qián)草總生物堿對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01；

3.2 排錢(qián)草總生物堿對(duì)對(duì)HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響：由表2提示，排錢(qián)草總生物堿在終濃度為75μg/mL時(shí)，能抑制HSC-T6 細(xì)胞生成COL-Ⅲ含量，與空白組照比較，有顯著差異(P<0.01)；當(dāng)排錢(qián)草總生物堿在終濃度為150μg/mL時(shí)，能抑制HSC-T6細(xì)胞生成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ膠原和TGF-β1、PDGF細(xì)胞因子的含量，與空白組照比較，有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。

表2 排錢(qián)草總生物堿對(duì)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

大多數(shù)慢性肝病共有的病理特征是肝纖維化，它也是慢性肝炎、肝硬化進(jìn)一步發(fā)展并惡化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。有資料表明，肝纖維化患者中，會(huì)有20%～40%最終會(huì)發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。廣西是肝病的高發(fā)綠地區(qū)，有效地抑制肝纖維化的發(fā)生以及發(fā)展，對(duì)防治肝硬化甚至肝癌就具有及其重要的意義。肝纖維化的發(fā)生與肝細(xì)胞外間質(zhì)ECM成份的合成與降解、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)及許多細(xì)胞(主要以貯脂細(xì)胞)的參與有關(guān)。膠原蛋白作為組成 ECM 的主要成份，在肝纖維化的形成中具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)27種膠原分子[8]，其中以COL-I、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ為主，是肝纖維形成的重要標(biāo)志。Ⅳ型膠原主要由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是基膜的主要膠原成分，在肝纖維化早期階段產(chǎn)生，并啟動(dòng)參與肝纖維化的各種因子，繼而導(dǎo)致Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積。在肝纖維化早期以COL-Ⅲ為主，而到肝纖維化后期則主要是COL-I為主。因此抑制膠原的異常合成、促進(jìn)沉積膠原的降解，在預(yù)防與治療肝纖維化中起著十分重要的作用[9-10]。 已有研究表明了HSC激活的調(diào)節(jié)的過(guò)程有多種因子參與，但TGF-β和PDGF是分別引起肝纖維化和細(xì)胞增生的關(guān)鍵，是最重要的細(xì)胞因子[11-12]。當(dāng) HSC 活化時(shí)，它失去類(lèi)維生素A，并開(kāi)始表達(dá)新的受體，主要為PDGF 受體和TGF-β受體。活化的 HSC 通過(guò)自分泌和旁分泌 PDGF、TGF-β，促進(jìn) HSC 增殖，合成大量 ECM 并在肝內(nèi)沉積，產(chǎn)生纖維化瘢痕，導(dǎo)致肝纖維化[13-14]。因此，通過(guò)抑制TGF-β和 PDGF誘導(dǎo)的 HSC 細(xì)胞增殖能有效的減少甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，排錢(qián)草總生物堿對(duì)T6細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并能顯著降低T6細(xì)胞分泌的 COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、膠原含量，及細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF含量，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異，說(shuō)明在排錢(qián)草總生物堿抗肝纖維的作用機(jī)制與膠原蛋白與細(xì)胞因子合成有關(guān)，其具體機(jī)制可進(jìn)一步研究。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典:下冊(cè)[M]．上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1986:2092．

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[4]鐘鳴,余勝民,黃琳蕓,等.排錢(qián)草總生物堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化動(dòng)物相關(guān)指標(biāo)的作用[J].肝臟,2001,6(3):168-169.

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2017年1月24日收稿

Effect of Desmodium pulchellum(L.) benth Total Alkaloids on HSC-T6 Cell Proliferation and Content of Collage and Cytokine

CHEN Shao-feng ZHAO Xiang-pei YU Shen-min

National pharmaceutical research institute ,Guangxi zhuang autonomous region, Nanning 530001

Objective：To study the effect of total alkaloids of Desmodium pulchellum on the HSC-T6 proliferation and the content of collage andcytokine Method：Culture HSC-T6 cells in vitro,taking the total alkaloids of Desmodium pulchellum (final concentration were 500,250,125,62.5,31.25,15.625 μg/mL)act on the cell of HSC-T6 cell，adopting MTT colorimetric assay for cellsurvival rate after 48 hours and count IC50；The culture supernatant fluid was collected, the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF were measured by ELISA.Result: The total alkaloids of Desmodium pulchellum could inhibit HSC-T6 cell proliferation,and with the increase in drug concentration,the effect of inhibiting the more significant.The IC50was 337ug/mL；can significantly decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF，P<0.05或P<0.01.Conclusion: The total alkaloids of Desmodium pulchellum inhibited the proliferation of HSC-T6 cell and decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF.

total alkaloids of Desmodium pulchellum ;HSC-T6;cytokines

1.廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目：(No.2014GXNSFAA118258)2.廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃課題(No.桂科能14123006-6)

陳少鋒(1970-)，男(漢族)，廣西博白人，廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院副主任藥師，學(xué)士學(xué)位，主要從事中藥，民族藥藥理研究工作。

R291.8

A

1006-6810(2017)03-0049-03