免疫磁珠酶催化新技術在H7N9流感病毒高靈敏檢測中的應用

劉 鍵，王艷麗，趙 勇，，吳學敏，（中國檢驗檢疫科學研究院，北京0076；河南省人口和計劃生育科學技術研究院，河南鄭州5000；北京諾禾致源科技股份有限公司，北京迪安臨床檢驗所有限公司，北京069）

·檢驗與轉化醫學·

免疫磁珠酶催化新技術在H7N9流感病毒高靈敏檢測中的應用

劉 鍵1，王艷麗2，趙 勇1，3，吳學敏1，4（1中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176；2河南省人口和計劃生育科學技術研究院，河南鄭州450002；3北京諾禾致源科技股份有限公司，4北京迪安臨床檢驗所有限公司，北京102629）

目的：H7N9型禽流感是一種致病性較強的流感病毒亞型，該型流感病毒于2013年3月底在我國發現以來，已造成多人死亡，目前對此病毒還沒有疫苗，沒有特效藥，死亡率一直居高不下.在當今病原體檢測的主要方法中，病原體培養分離法、核酸擴增法以及ELISA方法靈敏度較高，但需要專業儀器設備和專業的實驗室；膠體金法檢測快速、操作簡便，但是，膠體金檢測靈敏度低.因而，結合當前國內外的最新科學發展，尋求一種快速、高靈敏、可現場檢測的新技術尤為迫切.方法：本研究結合海關口岸對傳染病病原體檢驗檢疫的需求，利用納米磁顆粒具有酶催化活性的特點，結合免疫層析技術，以H7N9病原體為檢測樣本，分析該新技術對H7N9病原體檢測的敏感性與可靠性.結果：該新技術檢測的敏感度比膠體金法可提高12個數量級.結論：該方法兼具膠體金技術的快速、簡便、可現場應用的優點，又具有高靈敏度的特性，具有發展為我國海關口岸檢驗檢疫新技術平臺的潛力.

納米磁珠；酶催化作用；高靈敏；H7N9

0 引言

有史以來，傳染病一直侵擾著人類，歷史上曾造成過幾次大的瘟疫，對人類的健康帶來了巨大的威脅.據世衛組織報告（2012－12－20），在過去30多年時間里至少出現了30種人類新發傳染病，包括2003年爆發的SARS疫情（中國）、2014年爆發的埃博拉（Ebola）疫情（西非國家）［1］、2015年爆發的中東呼吸綜合征（MERS）疫情（韓國）［2－3］，2015年5月爆發的寨卡病毒（Zika）疫情（巴西）［4－5］，這些疫情的爆發均預示著人類將面臨更多新發或再發傳染病的挑戰.流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，流感病毒顆粒外膜由兩種表面糖蛋白覆蓋，一種為血細胞凝集素（hemagglutinin，H），另一種為神經氨酸酶（neuraminidase，N），H又分為15個亞型，N分為9個亞型.流感病毒可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感依據流感病毒特征可分為HxNx共135種亞型，H7N9型禽流感就是其中一種致病性較強的亞型.該型流感病毒于2013年3月底在我國的上海和安徽兩地率先發現［6］.截至2016年1月10日，全國已確診該病134人，死亡37人，痊愈76人，病例分布于北京、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、河南、臺灣、福建、東莞、汕尾等地.這種病和普通呼吸道疾病差不多，但是非常危險，目前尚無疫苗、特效藥，死亡率一直居高不下，因此，研制該病的快速、高靈敏的檢測方法十分必要.

圖1 H7N9型禽流感病毒［6］

目前，病原體檢測的主要方法有培養分離法［7］、核酸擴增法［8－9］、ELISA法［10］和膠體金試紙條檢測［11］等.在這些方法中，病原體培養分離法、核酸擴增法以及ELISA方法靈敏度較高，但需要專業儀器設備和專業的實驗室；而膠體金法檢測快速、操作簡便，最有可能廣泛應用于病原體現場篩查的海關口岸檢驗檢疫領域，但是，膠體金檢測靈敏度低，這一缺點嚴重制約了其在檢驗檢疫領域的大范圍應用.免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）是近年來發展起來的一項新的免疫學技術，它將磁珠特有的優點與免疫學反應的高度特異性結合于一體，以免疫學為基礎，滲透到醫學、生物學等各個領域.免疫磁珠常應用于生化樣品復雜組分的分離，可有效提高分離速度和富集效率［12－14］.2007年，中科院閻錫蘊院士課題組發現磁納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）具有模擬過氧化物酶的催化功能（被命名為納米酶），能催化過氧化物酶的底物TMB（3，3'，5，5'?四甲基聯苯胺，3，3'，5，5'?Tetramethylbenzidine）、DAB（二氨基聯苯胺，3，3'?diaminobenzidine）、OPD（二氨基聯苯胺，3，3'?diaminobenzidine）顯色［15－16］，進一步放大信號，這一發現拓展了磁納米材料在生物、醫學、檢測等多領域的應用.2015年，該課題組又首次將磁納米顆粒的酶催化活性與免疫層析技術相結合，實現了埃博拉假病毒的高敏感檢測［17］.這些研究報道說明免疫磁珠酶催化技術有望提高現有膠體金免疫層析技術的敏感性，可為我國海關口岸檢驗檢疫提供一種快速、簡便、高敏感、可現場使用的新技術.為了檢驗這一新技術的可行性及其潛在的應用前景，本研究以H7N9流感病毒為例，基于磁珠納米顆粒的酶催化放大特性，開展了免疫磁珠酶催化新技術在流感病毒高靈敏檢測中的應用研究，并對比免疫磁珠層析與膠體金免疫層析的檢測結果，評價其在海關口岸檢測中的應用前景.

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器FeCl3·6H2O、醋酸鈉、乙二醇、乙醇（北京化學試劑廠），TMB顯色液（中杉金橋），高溫烘箱（天津泰斯特），透射電鏡（JEOL 2000FX 200KV，日本電子公司），酶聯免疫分析儀（Bio?Rad，伯樂生命醫學產品有限公司），噴膜機（imagene technology，New Hampshire，USA），切條機（上海金標）.

1.2 免疫磁珠酶催化新技術的設計思路利用磁珠納米顆粒酶催化的特性，采用膠體金試紙條類似的設計策略，將膠體金納米顆粒替換為具有酶活性的磁珠納米顆粒，與檢測抗體偶聯，從而構建免疫磁珠抗體探針.當免疫磁珠抗體探針與樣品中的H7N9病原體結合后，層析至試紙條的檢測線（T線，噴涂有H7N9的捕獲抗體）與對照線（C線，噴涂有羊抗鼠抗體）時，免疫磁珠抗體探針與H7N9的復合物就會與T線處的捕獲抗體、C線處的羊抗鼠抗體結合，從而在T線與C線形成磁珠納米顆粒的聚集，這時加入過氧化物酶的底物如DAB，由于磁珠納米顆粒的酶活性，就會催化DAB發生化學反應生成大量棕褐色的沉淀，將檢測信號放大10～100倍，實現H7N9的快速高敏感檢測（圖2）.

圖2 高敏感免疫磁珠酶催化試紙條檢測技術

1.3 磁珠納米顆粒的合成與表征、酶活性測試根據水熱法的文獻報道［18］，合成磁珠納米顆粒.FeCl3·6H2O溶解于乙二醇中，然后加入一定量的醋酸鈉，混合后封裝于高壓反應容器中，200℃反應16 h，得到的產物用乙醇清洗3次，然后烘干保存.得到的磁珠納米顆粒用透射電鏡（JEOL 2000FX 200KV）表征其形態和均一性.另外，對合成的磁珠納米顆粒，測試其酶催化活性，實驗過程：96孔板中，每100 μL TMB顯色液為一反應體系，分別在每一反應體系中加入0、0.5、1、2、4、8 μg的磁珠納米顆粒，每一濃度的反應做3個重復，室溫反應5 min后，酶聯儀讀取OD 652的吸光度值.

1.4 免疫磁珠抗體探針的制備免疫磁珠抗體探針的制備依據文獻報道［19］，首先將5 mg的EDC（1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽，1?（3?Dime?thylaminopropyl）?3?ethylcarbodiimidehydrochloride）（Sigma?Aldrich）與NHS（N?羥基琥珀酰亞胺，N?Hydroxysuccinimide）（Sigma?Aldrich）溶解于1 mL的去離子水中，然后將制備好的磁珠納米顆粒5 mg加入至上述混合溶液中；30 min后，用去離子水洗兩次磁珠納米顆粒，然后取100 μg／mL的H7N9鼠單克隆抗體M?H7N9（上海安研）與磁珠納米顆粒孵育反應（pH6.0 NaAc溶液，4℃過夜或者37℃1 h）；反應后用PBS清洗兩次，最后保存于PBS溶液中.

1.5 免疫磁珠酶催化試紙條的組裝免疫磁珠酶催化試紙條的組裝依據文獻報道［20］，并做了少許改進，具體為：首先將硝酸纖維素膜（Millipore）、吸水墊粘貼于背板（20.0 cm×2.5 cm）上，然后用噴膜機噴涂檢測線與對照線.檢測線噴涂H7N9兔多克隆抗體R?H7N9（上海安研），對照線噴涂羊抗鼠抗體（Sigma?Aldrich）.噴涂后放置于37℃干燥1 h，然后采用切條機切成25 mm×5 mm的試紙條，室溫干燥保存.

1.6 免疫磁珠酶催化試紙條對H7N9病原體的檢測

首先將免疫磁珠抗體探針稀釋到1%BSA?PBS中，然后取7 μL混合到70 μL梯度稀釋的待檢測H7N9滅活病毒的培養上清溶液（1∶2，1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000），混合后將制備好的免疫磁珠層析試紙條插入溶液中，層析反應10～15 min后，取出試紙條放入DAB顯色液（Sigma?Aldrich）中反應3～5 min，觀察試紙條T線、C線上的顏色信號，判斷檢測結果.同時測試膠體金試紙條對H7N9滅活病毒的檢測，實驗流程同納米酶試紙條流程.

2 結果

2.1 磁珠納米顆粒的合成與表征合成的磁珠納米顆粒粒徑均一性較好，大小為200～250 nm（圖3）.

圖3 磁納米顆粒電鏡表征圖

對磁珠納米顆粒酶活性進行測試，根據OD 652的讀值，做出酶活性與所加磁珠納米顆粒量的對應關系（表1，圖4），可以看出，在100 μL反應體系中，當加入4 μg磁珠納米顆粒時，基本達到最大反應活性，當再增加磁珠納米顆粒用量時，反應活性增加較少.

表1 磁珠納米顆粒酶活性測試結果

圖4 磁珠納米顆粒酶活性測試分析

2.2 磁珠納米顆粒、膠體金試紙條對H7N9的檢測結果磁珠納米顆粒對H7N9滅活病毒最低的檢測限為1∶10000～1∶1000（1∶1000時信號非常明顯，1∶10000時也可看到檢出信號）.當稀釋濃度為1∶100000時，不能夠檢出；而膠體金對H7N9滅活病毒最低的檢測限為1∶100，當稀釋濃度為1∶1000時，不能夠檢出，說明磁珠納米顆粒酶活性試紙條的檢測敏感性比膠體金的高出1～2個數量級（圖5）.

圖5 磁珠納米顆粒、膠體金試紙條對H7N9的檢測

3 討論

本研究利用磁珠納米顆粒的酶催化活性，通過酶催化底物形成大量棕褐色沉淀，從而增強檢測信號的策略，研發了H7N9病原體的磁珠納米顆粒酶催化免疫層析試紙條檢測方法，實驗結果表明免疫磁珠酶催化試紙條的檢測敏感性比目前通用的膠體金法高出1～2個數量級，這種新的設計策略為提高免疫層析技術的靈敏度提供了新思路.但本研究所提出的這種新方法仍有改進的地方，比如在免疫層析后，需要將試紙條浸入顯色液中反應顯色，這個過程如能簡化為顯色試劑直接滴加到試紙條上則可節約試劑也可節約時間，這也是本研究作者目前正在優化的工作.總體來講，由于磁珠納米顆粒制備容易、穩定性好等特點，疫磁珠酶催化試紙條可以被推廣為一種通用的檢測新技術，這也為流感病毒的快速、高靈敏檢測，為我國海關口岸的檢驗檢疫及衛生防控提供了一個新的檢測技術平臺.

4 致謝

感謝中國科學院生物物理研究所閻錫蘊院士、段德民副研究員在課題實施過程中給予的建議和指導.

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S855.3

A

2095?6894（2017）04?52?04

2016－12－13；接受日期：2016－12－30

國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2015IK319）

劉 鍵.副研究員.研究方向：傳染病檢測.

E?mail：liuj9919＠163.com