黃芩苷在原代心肌細胞氧化損傷中的保護作用及機制研究

邱麗滿，林婧，2，褚劍鋒，2，3，林久茂，2，彭軍，2，3

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建福州350122）

黃芩苷在原代心肌細胞氧化損傷中的保護作用及機制研究

邱麗滿1，林婧1，2，褚劍鋒1，2，3，林久茂1，2，彭軍1，2，3

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建福州350122）

目的通過體外實驗研究黃芩苷在心肌細胞氧化損傷中的保護作用及其機制。方法取SD乳鼠心肌細胞進行原代培養，按各實驗需要分組并干預。采用MTT法檢測不同劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型中細胞活力的影響，采用Western Blot法檢測不同劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型DNA雙鏈斷裂損傷指標γ-H2AX和核內β-catenin表達的影響，并用Wnt／β-catenin信號通路激活劑LiCl干預，進一步探討黃芩苷在對心肌氧化損傷細胞模型的保護機制。結果心肌氧化損傷細胞模型的細胞活力顯著下降，γ-H2AX和核內βcatenin的蛋白表達明顯上調；低劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型的細胞活力和γ-H2AX、核內β-catenin的表達無明顯影響；而中、高劑量黃芩苷能夠明顯阻止受損心肌細胞活力下降，并下調心肌氧化損傷細胞模型的γ-H2AX和核內β-catenin的表達；且高劑量黃芩苷能夠下調Wnt／β-catenin信號通路激活劑LiCl干預下的原代心肌細胞γ-H2AX和核內β-catenin的表達水平。結論黃芩苷能夠通過抑制Wnt／β-catenin信號通路，阻止心肌細胞氧化損傷。

黃芩苷；心肌細胞氧化損傷；γ-H2AX；Wnt／β-catenin信號通路

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是嚴重危害人類健康與生命的心血管病急癥，其死亡率極高。在缺血心肌中，未修復的缺血損傷所引起的DNA損傷和活性氧（ROS）的產生，被認為是心肌細胞氧化損傷的主要機制［1-3］。DNA雙鏈斷裂是一種致命的DNA損傷，其斷裂部位產生的γ-H2AX能夠募集損傷修復相關蛋白到損傷位點，最終引起DNA修復等反應［4，5］。H2O2是一種重要的ROS，它可作為第二信使刺激和調節DNA損傷的發生［6］。我們的前期研究發現：抑制Wnt／β-catenin信號通路在阻止心肌缺血DNA損傷的發生及促進DNA修復中具有重要意義［7］。

中藥單體黃芩苷（baicalin）是一種從中藥黃芩干燥根部提取出來的活性成分。越來越多的研究表明，黃芩苷具有良好的心臟保護作用［8-10］，但其保護機制仍不明確。因此，我們擬用H2O2刺激原代心肌細胞建立心肌氧化損傷細胞模型，通過實驗明確黃芩苷對氧化損傷的心肌細胞的保護作用，并探討其可能的保護機制。

1材料

1.1藥物和動物黃芩苷購于成都曼思特生物科技有限公司；新生SD（Sprague-Dawley）乳鼠購于上海杰斯捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2013-0006。

1.2試劑DMEM低糖培養基（維森特生物技術有限公司）；胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素混合液（雙抗）、0.25%含EDTA胰酶、0.1%不含EDTA胰酶（美國Thermo公司）；LiCl（美國Sigma公司）；細胞核和胞質蛋白提取試劑盒、DMSO（上海生工生物工程股份有限公司）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；β-catenin抗體、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；γ-H2AX抗體、TFIIB抗體（英國Abcam公司）；二抗（美國Thermo公司）。

1.3主要儀器二氧化碳培養箱、恒溫磁力攪拌器（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統（德國Leica儀器有限公司）；多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；化學發光顯影儀（美國GE公司）。

2方法

2.1試劑配置黃芩苷用DMSO配制成儲存液，分裝于-20℃貯存備用。DMEM低糖完全培養基含10%FBS和1%雙抗，4℃冰箱保存備用。

2.2原代心肌細胞培養及心肌氧化損傷細胞模型的建立取出生1～3 d SD乳鼠的心臟組織于預冷的PBS內，清洗后剪碎，用0.01%不含EDTA胰酶分多次消化（37℃水浴，100 rpm，攪拌10 min），每次消化得到的細胞懸液于20%FBS的完全DMEM培養基（低糖）中和；離心1 000 rpm，7 min，棄上清，用完全培養基重懸后紗網過濾，將細胞鋪在φ10cm培養皿中；利用差異貼壁分離得到心肌細胞，接于φ3.5 cm培養皿中，置于37℃、5%CO2和飽和濕度的二氧化碳培養箱中培養，24 h后更換培養基，48 h后用PBS清洗并更換培養基用于后續實驗。用H2O2刺激原代心肌細胞誘導心肌氧化損傷細胞模型的建立。

2.3采用MTT法檢測細胞活力將取得的原代心肌細胞分成對照組、低劑量組（10 μM黃芩苷）、中劑量組（25 μM黃芩苷）、高劑量組（50 μM黃芩苷）和模型組（200 μM H2O2）、模型＋低、中、高劑量組。黃芩苷預處理24 h后，用H2O2干預2 h，建立心肌氧化損傷細胞模型。PBS清洗細胞后每孔加0.1 mL的MTT（0.5 mg／mL）于細胞培養箱內孵育4 h，棄MTT，加入DMSO后震蕩，通過酶標儀測定570 mm波長下各孔吸光度值，并進行數據分析及圖表制作。

2.4采用Western Blot法檢測γ-H2AX和核內βcatenin的表達將取得的原代心肌細胞分成對照組、模型組（100 μM H2O2）、模型＋低、中、高劑量組，用于檢測黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型γ-H2AX和核內β-catenin表達的影響。將取得的原代心肌細胞分成對照組、黃芩苷組（50 μM黃芩苷）、LiCl組（10 mM LiCl）、黃芩苷＋LiCl組（50 μM黃芩苷＋10 mM LiCl），用于檢測黃芩苷對Wnt／βcatenin信號通路激活劑LiCl誘導下的γ-H2AX和核內β-catenin表達的影響。黃芩苷、LiCl預處理24 h后，用H2O2干預30 min，建立心肌氧化損傷細胞模型。提取細胞總蛋白、核蛋白，采用Western Blot法檢測各組細胞γ-H2AX和細胞核內β-catenin表達的影響，并用凝膠成像系統進行圖像數據分析。

2.5統計學方法實驗數據采用SPSS 20.0版本軟件進行統計分析。計量資料采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

3結果

3.1黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型細胞活力的影響MTT結果表明：低、中、高劑量黃芩苷單獨干預對正常原代心肌細胞的細胞活力無明顯影響，結果見圖1A。低、中、高劑量黃芩苷能夠明顯改善氧化受損心肌細胞的活力，尤其中、高劑量黃芩苷改善更為明顯，結果見圖1B。

圖1黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型細胞活力的影響

3.2黃芩苷對心肌損傷細胞模型細胞γ-H2AX和核內β-catenin蛋白表達的影響Western Blot結果顯示：與對照組相比，心肌氧化損傷細胞模型組的γ-H2AX和細胞核內β-catenin的表達顯著上調；與模型組比較，低劑量黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型γ-H2AX和核內β-catenin的表達變化無明顯影響，而中、高劑量黃芩苷能夠顯著下調心肌缺血損傷細胞模型γ-H2AX和核內β-catenin的表達，提示黃芩苷可能通過抑制β-catenin，調控Wnt／β-catenin信號通路，進而下調心肌氧化損傷細胞模型γ-H2AX的表達。結果見圖2。

圖2黃芩苷對心肌氧化損傷細胞模型γ-H2AX和核內β-catenin蛋白表達的影響

3.3黃芩苷對LiCl誘導下的γ-H2AX和核內βcatenin蛋白表達的影響Western Blot結果顯示：黃芩苷單獨干預能夠明顯下調心肌原代細胞核內β-catenin的表達，且對γ-H2AX的表達無影響；用Wnt／β-catenin信號通路的激活劑LiCl單獨干預能夠顯著上調心肌原代細胞γ-H2AX及其核內βcatenin的表達，表明促進Wnt／β-catenin信號通路活化能夠增加原代心肌細胞γ-H2AX的表達；而與LiCl干預組比較，黃芩苷＋LiCl組的γ-H2AX和核內β-catenin的表達水平顯著降低，表明黃芩苷能夠抑制LiCl對Wnt信號通路的激活作用，進而下調氧化損傷心肌細胞γ-H2AX的表達，結果見圖3。

圖3黃芩苷對LiCl誘導下的γ-H2AX和核內β-catenin蛋白表達的影響

4討論

目前，臨床上治療AMI的方法主要是抗血小板凝集、溶栓等藥物治療以及建立側枝循環的手術治療等［11-13］，這些急救措施主要局限于處理已經閉塞的血管，使其再通，從而恢復心肌的血供，但是，這些治療手段并不能挽救已經發生不可逆損傷的缺血組織。顯然，只有阻止細胞死亡，才能對其后續血管再通、血管新生的治療提供良好的治療基礎。

組織發生缺血時，短時間內細胞內ROS大量增多，超過細胞抗氧化處理能力，導致機體處于氧化應激狀態并誘發DNA氧化性損傷，DNA損傷是缺血導致的組織損傷最早出現的反應［14］，過度的DNA損傷會導致細胞死亡。阻止及修復DNA損傷，將有望阻止心肌發生不可逆性損傷，為心肌缺血的治療延長治療時機。

我們的研究發現：黃芩苷能夠明顯阻止心肌缺血損傷細胞模型中細胞活力的下降，下調細胞DNA雙鏈斷裂指標γ-H2AX及細胞核內β-catenin表達，且黃芩苷能夠抑制LiCl所上調的Wnt信號通路的活性和γ-H2AX的蛋白表達水平。上述結果表明：黃芩苷能夠通過抑制Wnt／β-catenin信號通路的活化，阻止缺血所導致心肌細胞的DNA氧化損傷。

此外，黃芩苷在成藥方面具有兩大優勢：①黃芩苷在多種急慢性炎癥的臨床治療中已經有運用，其安全性及有效性已經得到證實；②黃芩苷作為小分子化合物，成藥方便，造價較低。基于我們的研究發現及黃芩苷的成藥優勢，我們認為：黃芩苷將有望成為臨床上治療AMI的有效藥物。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0031-03

2016-12-28

陳可冀中西醫結合發展基金（CKJ2016005）；國家自然科學基金（81302884）。

邱麗滿（1990—），女，碩士研究生，主要從事中西結合心血管疾病的基礎研究。

彭軍（1969—），男，研究員，醫學博士，博士生導師。

E-mail：pjunlab@hotmail.com