外用8-甲氧補骨脂素誘導的黃褐斑動物模型研究

蘇美麗，許亞瑩，張理平

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

外用8-甲氧補骨脂素誘導的黃褐斑動物模型研究

蘇美麗，許亞瑩，張理平

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的采用綜合造模法創建小鼠皮膚黃褐斑動物模型。方法30只KM雌性小鼠隨機分為空白組、造模1組、造模2組。除空白組外，造模1組和造模2組根據文獻均每日用波長320 nm的中波紫外線（UVB）照射小鼠背部皮膚1次，照射時間30 s，并每日定時肌肉注射1%黃體酮注射液2 mL／kg體重，兩腿交替注射；同時每日將小鼠置于特制的束縛桶內束縛30 min；造模2組同時局部外涂8-甲氧補骨脂素（8-MOP），每日1次。造模4周后，HE染色和免疫組化染色觀察皮膚黑色素細胞病理形態學。結果①HE染色結果：造模1組和造模2組小鼠皮膚黑色素細胞的上皮層增生數、真皮血管數和真皮炎性細胞數高于空白組（P＜0.01）；造模2組小鼠皮膚黑色素細胞的上皮層增生數、真皮血管數和真皮炎性細胞數高于造模1組（P＜0.01）。②免疫組化染色結果：造模1組和造模2組小鼠皮膚黑色素細胞的HIS、平均光密度和積分光密度高于空白組（P＜0.01）；造模2組小鼠皮膚黑色素細胞的HIS、平均光密度和積分光密度高于造模1組（P＜0.01）。結論采用小鼠皮膚局部黃體酮注射+慢性束縛＋局部紫外線照射＋外涂8-甲氧補骨脂素的綜合實驗方法建立的黃褐斑小鼠模型，更加接近人類黃褐斑病變特征。

黃褐斑；黃體酮；紫外線；慢性束縛；8-甲氧補骨脂素

黃褐斑（chloasma）是一種多因素產生的慢性皮膚色素代謝障礙性疾病，至今尚無療效確切的治療藥物。本研究根據內分泌失調、日曬是黃褐斑產生的主要因素，皮損區黑色素細胞分泌黑色素顆粒增多是其主要病理變化的機制，采用小鼠皮膚局部黃體酮注射＋慢性束縛＋局部紫外線照射＋外涂8-甲氧補骨脂素（8-MOP）［1］的綜合實驗方法造模，為建立更加接近人類黃褐斑病變特征動物模型提供實驗依據。

1實驗材料

1.1實驗動物清潔級KM雌性小鼠，體質量（20± 2）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：00513712。

1.2藥物及試劑甲氧沙林溶液（重慶華邦制藥有限公司）；黃體酮注射液（20 mg／支，浙江仙琚制藥股份有限公司）；一抗bs-7362R（南京建成生物工程研究所）

1.3儀器UV236B中波紫外線照射儀（德國Waldman公司）；BX51T-PHD-J11顯微鏡（日本奧林巴司公司）；形態學顯微圖像分析系統（德國徠卡儀器有限公司）

2實驗方法

2.1分組與造模小鼠購回飼養1周后，按隨機數字表法分為空白組、造模1組、造模2組，每組各10只。具體造模方法如下：①空白組：用10%的NaS2水溶液背部脫毛，每2 d脫毛1次，背部裸露約2 cm×2.5 cm的皮膚；每日肌肉注射注射用生理鹽水5 mL／kg體重。②造模1組：脫毛同空白組，每日用波長320 nm的中波紫外線（UVB）照射小鼠背部皮膚1次，照射時間30 s；并每日定時肌肉注射1%黃體酮注射液2 mL／kg體重，兩腿交替注射；同時每日將小鼠置于特制的束縛桶內束縛30 min。③造模2組：方法同組②，同時局部外涂8-甲氧補骨脂素，每日1次。

2.2標本采集造模完4周后取各組小鼠背部脫毛部位皮膚一塊（約0.5 cm×1 cm），剔除其皮下脂肪和黏液組織，用4℃的預冷生理鹽水沖洗干凈，拭干水分。用4%的多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。

2.3指標觀察

2.3.13組小鼠皮膚黑色素細胞的病理形態學觀察切片經HE染色，每張切片選取5個不同視野，根據圖象分析管理系統計數上皮層增生數、真皮血管數及真皮炎性細胞數；切片經免疫組化染色，每張切片選取5個不同視野，根據圖象分析管理系統計算黑素細胞染色面積和程度。

2.3.2顯微鏡圖像分析黑色素細胞用CMOS計算機圖像處理系統和專用軟件進行圖象分析，每例觀察5個不同視野。確定黑色素細胞后，用多功能真彩色細胞圖象分析管理系統對目標圖象進行定量分析：400倍視野下統計黑色素細胞百分比，觀察其染色程度并進行免疫組化評分（immunohistochemical score，HIS）。評分方法如下［4］：A為陽性細胞百分率，A＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分；B為陽性細胞染色程度，B為陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。A、B兩項乘積即為該例組織的HIS，并根據圖象分析管理系統計算出平均光密度和積分光密度。

2.4統計學方法用SPSS 20.0統計軟件進行統計處理。計量資料均符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3實驗結果

3.13組小鼠皮膚黑色素細胞HE染色結果空白組鱗狀上皮較薄，無增生，由排列整齊的基底細胞和棘細胞組成，共1～2層，表面有少量角質；真皮中見正常的毛囊、皮脂腺，未見汗腺、血管、炎性細胞；結締組織、皮下脂肪及肌肉組織未見特殊。造模1組小鼠皮膚的上皮層較空白組增生明顯，共約2～3層，角質層增厚，表皮細胞數增多，毛囊和皮脂腺增生明顯，血管、炎性細胞增多。造模2組小鼠皮膚的上皮層較造模1組明顯增生，共約4～6層，角質層增厚，表皮細胞數增多，毛囊和皮脂腺增生明顯，血管、炎性細胞明顯增多。見圖1。

圖13組小鼠皮膚HE染色圖（×200）

3.23組小鼠皮膚黑色素細胞上皮層增生數、真皮血管數、真皮炎性細胞數比較見表1。3.33組小鼠皮膚黑色素細胞免疫組化結果空白組小鼠皮膚表皮中幾乎未見黑色素細胞，基底層可見單個散在分布的黑色素細胞，胞漿著色呈棕黃色。造模1組小鼠皮膚表皮中可見少量黑素色細胞，基底層可見多個散在分布的黑色素細胞，著色面積較空白組大。造模2組皮膚表皮中可見大量黑色素細胞，表皮基底層可見多個成簇分布的黑色素細胞，著色面積較造模1組大，呈強陽性反應，胞漿著色呈深褐色。見圖2。

表13組小鼠皮膚黑素細胞上皮層增生數、真皮血管數、真皮炎性細胞數比較（x±s）

圖23組小鼠皮膚黑素細胞免疫組化圖

3.43組小鼠皮膚黑色素細胞HIS、平均光密度、積分光密度比較見表2。

4討論

8-甲氧補骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）主要存在于多種常見中草藥如蛇床子、北沙參、白芷、枳實、羌活、芫荽等根莖或果實中，由于8-MOP結構簡單，易與DNA發生相互作用，有較多的生物活性［5］。8-MOP對鼠類B16黑色素瘤細胞株具有較好的促進黑色素生成作用［6］，是治療白癜風的藥物。其外用的機理為：8-MOP是光敏性化合物，能增加黑色素細胞的密度，增加黑色素細胞中酪氨酸酶的活性，從而促進黑色素的生化合成、轉運和擴散［7］。該作用機制與黃褐斑產生的機理頗為相似，為此，我們在目前文獻報道的多因素黃褐斑小鼠動物模型研究的基礎上（紫外線照射＋黃體酮注射＋慢性束縛法［2-3］），增加外用促進黑素細胞分泌黑素的藥物（8-MOP）的方法進行小鼠黃褐斑動物模型的建立，以期創建更加符合人類黃褐斑產生的動物模型，為治療黃褐斑新藥研究奠定基礎。

表23組小鼠皮膚黑素陽性目標HIS、平均光密度、積分光密度比較（x±s）

目前，判斷黃褐斑動物模型成功與否的重要指標有皮膚黑色素細胞病理形態學觀察以及生化指標檢測。而前者是最直接、最客觀的指標。光密度是反映物體顏色的深淺度，是反映物體對光的吸收率（透過率）的指標。顏色越深，對光線的吸收越多，光密度越高。積分光密度是平均光密度與面積的乘積，顏色越深，面積越大，積分光密度越高［8］。因此，平均光密度、積分光密度可作為觀察黑素細胞著色深淺度的量化指標。

本實驗中，我們在光鏡下觀察到造模2組小鼠皮膚黑色素細胞較造模1組明顯增多。而計算機的病理圖像學定量分析結果顯示：造模2組同造模1組及空白組比較，小鼠皮膚黑色素的HIS、平均光密度、積分光密度均有顯著性差異。因此，采用小鼠皮膚局部黃體酮注射+慢性束縛+局部紫外線照射+外涂8-MOP的綜合實驗方法建立的黃褐斑小鼠模型是成功的。但是沒有對模型的穩定性和維持時間進行觀察，如果模型不夠穩定或維持時間過短，在藥物治療實驗過程很難對藥物的有效性做出評價。因此，模型穩定性或維持時間是評價模型是否成功的關鍵，這些不足有待進一步研究完善。

［1］張理平.治療黃褐斑中藥研究的思索［J］.中華醫學美學美容雜志，2005，11（4）：248-249.

［2］汪南玥，陳家旭，吳曉丹.肝郁型黃褐斑小鼠模型的建立及其與現有模型的比較研究［J］.中華中醫藥雜志，2007，22（5）：161-163.

［3］薄純光.黃褐斑肝氣郁證小鼠模型的建立及消斑靈干預［D］.濟南：山東中醫藥大學，2013：1-31.

［4］YING M A，LIN M A，QUAN GUO，et al.Expression of bone morphogenetic protein-2 and its receptors in epithelial ovarian cancer and their influence on the prognosis of ovarian cancer patients［J］.Joural of Experimental&Clinical Cancer Research，2010，29（1）：461-462.

［5］楊倩，楊儉.8-甲氧補骨脂素藥理作用研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2014，19（10）：1177-1178.

［6］YE Y，CHOU G X，WANG H，et al.Flavonoids apigenin snd icariin exert poten melanogenic activities in murine B16 melanoma cells［J］.Phytomedicine，2010，18（1）：32-35.

［7］龔小梭.8甲氧補骨脂素和艾洛松聯合外用治療白癜風60例［J］.皮膚病與性病，2006，28（2）：42-43.

［8］汪薇，王詩航.光密度值測定在實驗醫學研究中的應用及意義［J］.解剖科學進展，2006，12（3）：286.

R285.5

A

1000-338X（2017）02-0053-03

2017-12-15

福建中醫藥大學大學生創新創業訓練計劃項目

（201610393080）

蘇美麗（1991—），女，碩士研究生，主要從事中醫美容方藥的研究。

張理平（1958—），女，教授、碩士生導師。

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