視黃醛脫氫酶1在膽囊癌中的表達及其臨床意義

黃海林，陳 超，甘 泉，杜哲明

視黃醛脫氫酶1在膽囊癌中的表達及其臨床意義

黃海林，陳 超，甘 泉，杜哲明

目的 觀察視黃醛脫氫酶1(retinal dehydrogenase 1，ALDH1A1 )在膽囊癌組織中的表達及其臨床意義。方法 采用組織芯片技術和免疫組織化學方法檢測59例膽囊癌組織標本，7例癌旁組織標本及6例慢性膽囊炎組織標本中ALDH1A1表達情況。結果 ALDH1A1在6例慢性膽囊炎和7例癌旁組織中全部陽性表達，在59例膽囊癌組織中，ALDH1A1表達率為62.7%(37/59)，慢性膽囊炎、癌旁組織與膽囊癌組織中ALDH1A1表達差異有統計學意義(P<0.05)。ALDH1A1與疾病進展和組織分化呈負相關，表達差異有統計學意義(P<0.05)。結論 膽囊癌組織中ALDH1A1蛋白的表達與疾病進展和組織分化呈負相關。

膽囊癌；組織芯片技術；視黃醛脫氫酶1

膽囊癌是相對罕見的疾病，在胃腸道腫瘤中僅占4%，限于黏膜層的腫瘤5年生存率為32%，而進展期的腫瘤1年生存率只有10%[1-4]。目前腹腔鏡膽囊切除術(laparoscopic cholecystectomy, LC)是膽囊炎治療的金標準，超過80%的膽囊炎通過LC治療，因此，意外膽囊癌的機會大大增加。0.3%～1.0%的LC患者通過術后病理診斷為膽囊癌[5-7]，單純性膽囊切除在T1a期腫瘤足夠，但是對于T1b期腫瘤及T2期腫瘤，應選擇二次手術。膽囊癌缺乏有效的診斷指標，以至使臨床醫師非常困惑。本研究通過組織芯片技術和免疫組織化學方法檢測，在蛋白組學中尋找膽囊癌組織差異表達蛋白ALDH1A1的表達情況，并探討其與腫瘤臨床病理間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本 收集2004-01至2007-12上海長征醫院及武警江西總隊醫院存檔的59例膽囊癌石蠟標本。男21例，女38例。<60歲21例，≥60歲37例，1例年齡缺失，平均年齡61.5歲。病理診斷結果經兩名以上病理醫師確認。腺癌54例，其他5例(腺鱗癌4例，未分化癌1例)，其中有淋巴結轉移12例，肝臟侵犯13例。臨床分期采用膽囊癌Nevin分期(1976)，其中54例具有明確的Nevin分期：Ⅰ期(癌組織僅限于黏膜內，即原位癌)2例，占3.70%；Ⅱ期(侵及肌層)7例，占12.96%；Ⅲ期(癌組織侵及膽囊壁全層)21例，占38.89%；Ⅳ期(侵及膽囊壁全層合并周圍淋巴結轉移)7例，占12.96%；Ⅴ期(直接侵及肝臟或轉移至其他臟器或遠處轉移)17例，占31.48%。隨機選取其中7例癌旁組織(離膽囊癌邊緣0.5 cm以上)。另外6例慢性膽囊炎標本為上海第二軍醫大學尸檢標本。

1.2 試劑與儀器 組織芯片構建儀(Tissue Arrayer)，購自美國BEECHER，INSTRUMENTS公司。兔抗ALDH1A1多克隆抗體(AP1445a)購自美國ABGENT公司； EnVision免疫組化試劑盒購自丹麥Dako公司；DAB顯色液配制：取DAB 5 mg溶于100 ml 0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)中，加入30%H2O210 μl，攪拌混勻后過濾(使用前配制)。

1.3 組織芯片制作 觀察并根據HE切片確定具有代表性的病變部位(癌和癌旁)，加以標記；制作大小45 mm×20 mm×20 mm的空白蠟塊；利用Tissue Arrayer在空白蠟塊中打孔(直徑2 mm)，而后在選取的組織蠟塊中穿取標記組織(直徑2 mm)，準確放入空白蠟塊的小孔中；按序依次操作，直至將所有所需組織標本種植于此空白蠟塊中，制作成組織芯片蠟塊；應用石蠟切片機進行連續切片，貼附于防蠟的載玻片上備用。

1.4 免疫組織化學染色 采用SP法，ALDH1A1工作濃度為稀釋比例1∶100；按試劑盒說明書進行操作，DBA顯色，蘇木精復染后中性樹膠封片，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.5 結果判定 顯微鏡下觀察，在良好的組織結構及清晰的背景上細胞內出現棕黃色顆粒為陽性，采用二級計分法：0分，陽性細胞計數<5%；1分，陽性細胞計數5%～<25%；2分，陽性細胞計數25%～<50%；3分，陽性細胞計數50%～<75%；4分，陽性細胞計數≥75%。染色強度分類：1分，淡黃色；2分，黃或深黃色；3分，褐或棕褐色。兩者計分相乘大于1者為陽性。

1.6 統計學處理 使用SPSS11.0軟件包進行數據處理。計數資料采用絕對數和率表示，組間率的比較采用χ2檢驗、四格表精確概率法分析，相關性分析用Pearson相關檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 構建1張組織芯片 成功制備1張膽囊癌組織芯片，含133個位點，共有4個點組織脫落，用普通切片補充，其余位點組織結構保存良好。

2.2 ALDH1A1在慢性膽囊炎、癌旁、膽囊癌組織中的表達 ALDH1A1蛋白陽性著色定位于細胞漿內，淡黃、棕黃或棕褐色(圖1)。ALDH1A1在6例慢性膽囊炎和7例癌旁組織中全部陽性表達，在59例膽囊癌組織中，ALDH1A1表達率為62.7%(37/59)，慢性膽囊炎、癌旁組織與膽囊癌組織中ALDH1A1表達差異有統計學意義(χ2=3.84，P<0.05)。

2.3 ALDH1A1表達與腫瘤生物學行為的關系 ALDH1A1與疾病進展和組織分化呈負相關，表達差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 ALDH1A1蛋白在慢性膽囊炎、癌旁組織及膽囊癌組織的表達情況(SP,×200)

A、B. 慢性膽囊炎并膽囊結石及癌旁組織中ALDH1A1蛋白高表達; C、D、E. 膽囊癌組織標本中ALDH1A1蛋白不表達或低表達

表1 ALDH1A1表達與腫瘤生物學行為的關系

3 討 論

組織芯片技術在腫瘤核酸、蛋白檢測中的應用，以及這種技術與基因芯片、蛋白芯片等其他生物學技術的結合應用，極大地豐富并促進了腫瘤的基礎性研究。應用該技術可快速、高效、經濟、簡便地進行大樣本高通量檢測，同時避免了操作及統計中造成的誤差，較好的克服了人為因素帶來的偏差。

視黃醛是視網膜上光感受器中視紫紅質的重要組分，視黃醛可被ALDH1A1氧化成具有轉錄調節活性的維A酸。本研究表明，ALDH1A1蛋白在6例慢性膽囊炎和7例癌旁組織中全部陽性表達，而在59例膽囊癌組織中，ALDH1A1的表達率分別為62.7%(37/59)。在研究ALDH1A1與膽囊癌臨床病理聯系時發現ALDH1A1與膽囊癌的Nevin分期和組織分化呈負相關。筆者在檢索關于ALDH1A1蛋白的文獻時發現無相關報道。可以推斷，當體內缺乏ALDH1A1時，維A酸產生減少，而維A酸是維生素A在體內的活性代謝產物。維A酸在胚胎及成年組織中有多種生物學活性，如在細胞增生、凋亡、分化、生殖、維持細胞正常功能等方面發揮重要作用。作為一種抗腫瘤藥維A酸已成功用于肺、肝、皮膚、膀胱和乳腺腫瘤動物模型，并作為急性早幼粒細胞白血病(APL)的治療藥物應用于臨床[8，9]。Manicassamy等[10]發現，維A酸可以抑制胃癌細胞生長，研究者采用不同濃度水平的維A酸作用于體外培養的胃癌細胞，并采取了不同時段的熒光顯微鏡觀察。他們發現，較低濃度水平的維A酸對細胞無明顯的抑制作用，而中等濃度水平(10～20 μl)可明顯抑制胃癌細胞的生長，且隨著作用濃度和作用時間的增加，其抑制作用增強。Markert等[11]發現，結腸腺瘤性息肉病(APC)腫瘤抑制基因通過調節維生素A向維A酸的轉化發揮了其控制作用。

[1] de Groen P C, Gores G J, LaRusso N F,etal. Biliary tract cancers [J]. N Engl J Med, 1999, 341(10): 1368-1378.

[2] Carriaga M, Henson D E. Liver, gallbladder, extrahepatic bile ducts, and pancreas [J]. Cancer,1995, 75(1): 171-190.

[3] Henson D, Albores-Saavedra J, Corle D. Carcinoma of the gallbladder: histologic types, stage of disease, grade, and survival rates [J]. Cancer, 1992,70(6): 1493-1497.

[4] Fong Y, Jarnagin W, Blumgart L H. Gallbladder cancer: comparism of patients presenting initially for definitive operation with those presenting after prior noncurative intervention [J]. Ann Surg, 2000, 232(5):557-569.

[5] Rosenmuller M, Haapamaki M M, Nordin P,etal. Cholecystectomy in Sweden 2000-2003: a nationwide study on procedures, patient characteristics, and mortality [J]. BMC Gastroenterol, 2007, 7(1): 35.

[6] Kozak L J, DeFrances C J, Hall M J. National hospital discharge survey: 2004 annual summary with detailed diagnosis and procedure data [J]. Vital Health Stat 13, 2006, 162 (11):1-209.

[7] Chan C P, Chang H C, Chen Y L,etal. A 10-year experience of unsuspected gallbladder cancer after laparoscopic cholecystectomy [J]. Int Surg,2003,88(3):175-179.

[8] Budin S B, Othman F, Louis S R,etal. Effect of alpha lipoic acid on oxidative stress and vascular wall of diabetic rats[J]. Rom J Morphol Embryol, 2009, 50(1): 23-30.

[9] Daiss N, Lobo G, Gonzalez M. Changes in postharvest quality of Swiss chard grown using 3 organic preharvest treatments[J]. J Food Sci, 2008, 73(6): S314-S320.

[10] Manicassamy S, Ravindran R, Deng Jiusheng,etal. Toll-like receptor 2-dependent induction of vitamin A-metabolizing enzymes in dendritic cells promotes T regulatory responses and inhibits autoimmunity [J]. Nat Med, 2009, 15(4): 401-409.

[11] Markert S, Lassmann S, Gabriel B,etal. Alpha-folate receptor expression in epithelial ovarian carcinoma and non-neoplastic ovarian tissue [J]. Anticancer Res, 2008, 28(6A): 3567-3572.

(2016-11-10收稿 2017-01-21修回)

(責任編輯 武建虎)

Expression and clinical significance of retinal dehydrogenase 1(ALDH1A1 )in gallbladder carcinoma by tissue microarray

HUANG Hailin, CHEN Chao, GAN Quan, and DU Zheming.

Department of General Surgery, Hospital of Jiangxi Provincial Corps, China People’s Armed Police Force, Nanchang 330030, China

Objective To explore the expression and clinical significance of retinal dehydrogenase 1(ALDH1A1) in gallbladder carcinoma.Methods The expressions of ALDH1A1 were detected in 59 specimens of gallbladder carcinoma tissues，7 specimens of adjacent non-tumor tissues and 6 specimens of chronic cholecystitis tissues by tissue microarray technique and immunohistochemistry.Results In 7 specimens of adjacent non-tumor tissues and 6 specimens of chronic cholecystitis tissues, there was a positive expression of ALDH1A1. The expression of ALDH1A1 was not detected or weakly positive in 59 gallbladder carcinoma tissue specimens and the positive rate was 62.7%(37/59). The positive rate of ALDH1A1 in tissue specimens of gallbladder carcinoma was significantly lower than the expression in the adjacent non-tumor tissues or chronic cholecystitis tissues(P<0.05). ALDH1A1 was negatively correlated with disease progression and tissue differentiation, and there was significant difference in levels of expression (P<0.05).Conclusions The expression of ALDH1A1 in gallbladder carcinoma tissues is negatively correlated with the progression of disease and tissue differentiation.

gallbladder carcinoma; tissue microarray technique; ALDH1A1

黃海林，博士，副主任醫師。

330030 南昌，武警江西總隊醫院外一科

R735.8