靜脈注射表達白細胞介素-12的HSV-1溶瘤病毒抗腫瘤機制的研究

關 毅，秦曉偉，李毅平，趙 剛

(吉林大學第一醫院 神經腫瘤外科,吉林 長春130021)

*通訊作者

靜脈注射表達白細胞介素-12的HSV-1溶瘤病毒抗腫瘤機制的研究

關 毅，秦曉偉，李毅平，趙 剛*

(吉林大學第一醫院 神經腫瘤外科,吉林 長春130021)

惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類生命的疾病，據世界衛生組織公布數據顯示，2012年全球新發癌癥病人約1410萬，病死率高達60 %左右[1]。雖然目前手術技術、放化療和靶向藥物等治療手段方面均取得了顯著的進步，但很難完全控制惡性腫瘤的侵襲、轉移，導致病人治療效果不佳?；蚋脑煸鲋沉呀庑訧型單純皰疹病毒，也叫HSV-I溶瘤病毒(onclytic HSV-I)，是目前國際上惡性腫瘤治療研究熱點之一。在動物模型上，HSV-I溶瘤病毒被證明對膠質瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有明顯的治療效果[2，3]。溶瘤病毒傳統給藥方式是腫瘤內直接注射，在將來臨床使用中有很大局限性。本研究的目的是通過靜脈注射方式給藥，在老鼠皮下腫瘤和腦腫瘤模型上，探討HSV-I溶瘤病毒與表達白細胞介素12(IL-12)HSV-I溶瘤病毒的抗腫瘤機制。本研究使用的第三代HSV-I溶瘤病毒T-01(G47Δ-empty)，是進一步將第三代HSV-I溶瘤病毒G47Δ ICP6區域基因打掉894對堿基，同時將表達鼠性融合型白細胞介素-12(IL-12)基因插入到ICP6區域而得到T-mfIL12。在體外乃至體內研究使用中，與G47Δ相比T-01的ICP6區域基因回復到野生型的幾率進一步降低，從而安全性又得到提高[4]。

1 材料和方法

1.1 細胞和HSV-I溶瘤病毒質粒構建

低免疫原性小鼠Neuro2a (neuroblastoma)腫瘤細胞和Vero細胞購自美國ATCC公司，細胞培養如文獻所述[2]，每種細胞均定期檢測，以防支原體感染。T-01(G47-empty)和T-mfIL12(表達鼠性IL-12的T-01)HSV-I溶瘤病毒質粒構建和增殖如文獻所述[4]，T-01是將第三代病毒G47Δ ICP6區域基因打掉894對堿基，同時將表達鼠性融合型IL-12基因插入到ICP6區域而得到T-mfIL12。利用Vero細胞采用空斑形成試驗測定病毒質粒滴度。

1.2 皮下腫瘤動物模型建立

本研究所用5周齡雌性HSV-I敏感A/J小鼠購自日本Sankyo公司。腫瘤模型建立具體方法如文獻所述[3]，將5×106Neuro2a腫瘤細胞懸液(0.1 ml無血清DMEM/F12)注入A/J小鼠左側肋腹部皮下，通常4天后會形成直徑5 mm左右皮下腫瘤(我們定為day0)，將小鼠隨機分為3組(n=6)，分別于day0、day2和day4實施治療，通過小鼠尾靜脈注射方式，分別將0.2 ml含有10%甘油PBS(對照組即mock組)、5×106pfu T-01和5×106pfu T-mfIL12(二者均為0.2 ml含有10%甘油PBS)注入小鼠體內，從第1次day0治療開始，每周測量3次腫瘤體積和小鼠體重，腫瘤體積測算采用：體積(tumor volume)=長×寬×高(mm3)。當皮下腫瘤最大徑≥24 mm時，處于人道主義終止實驗。測量腫瘤體積同時測量小鼠體重。

1.3 腦腫瘤動物模型建立

腦腫瘤模型建立具體方法如文獻所述[3]，即通過立體定向方式將5×104Neuro2a腫瘤細胞懸液(5 μl無血清DMEM/F12)注入A/J小鼠右額葉內(day0)，腫瘤細胞移植后第5、7、9天，通過尾靜脈注射將上述相同治療進行3次。從day0開始，觀察老鼠生存期，死亡小鼠進行解剖，確認是否有腦腫瘤形成。1.4 尾靜脈注射后小鼠體內臟器病毒分布測量

上述皮下腫瘤模型建立后，分別于day0、day2和day4尾靜脈注射T-01，治療結束后第1天(day5)收集皮下腫瘤、肺、肝、脾和腦(n=5)。DNA提取使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)，具體方法參考使用說明。采用real-time PCR測定病毒量(ABI Prism 7000)，引物為：primer 1:5’-GTCCCGCCGAACGCATACAT-3’；primer 2:5’-CCTCTTCGCTATTACGCCAG-3’[5]，50 μl反應體積包括18 μl dH2O，25 μl 2 x SYBR Green PCR Master Mix，1 μl 10 μM forward primer，1 μl 10 μM reverse primer，和 5 μl樣品DNA。反應條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40循環。病毒檢出界限為100 pfu/mg，未治療皮下腫瘤組織混有各種濃度T-01作為定量標準。最后結果由ABI Prism 7000軟件測定

1.5 ELISA測定血清中IL-12和IFN-γ

皮下腫瘤建立后day0時三組分別靜脈注射治療1次，day1麻醉A/J小鼠，采取內眼瞼靜脈叢血(n=3)，使用Mouse IL-12 p70 Immunoassay Kit (R&D)和Mouse IFN-γ ELISA Kit (ENDOGEN)分別測定血清中IL-12和IFN-γ含量。

1.6 統計學方法

皮下腫瘤體積測定分析采用t-test檢驗；腦腫瘤生存期分析采Kaplan-Meier法及Breslow-Gehan-Wilcoxon檢驗。

2 結果

2.1 靜注HSV-I溶瘤病毒明顯抑制皮下腫瘤生長

day14實驗結束時，三組A/J小鼠皮下腫瘤平均體積：T-mfIL12組僅為2 100 mm3±930 mm3，T-01組為4000 mm3±389 mm3，而對照組mock組則為6 000 mm3±354 mm3，從day7到day14，3組間均有明顯統計學意義(P<0.001)。結果說明HSV-I溶瘤病毒經靜脈投藥，具有顯著抗腫瘤效果，而IL-12還可明顯增強治療效果(圖1)。同時小鼠體重結果顯示3組間無明顯差別(P>0.05，結果未顯示)，我們沒有觀察到3組小鼠出現較明顯的全身或神經毒性等副作用。

圖1 A/J小鼠Neuro2a皮下腫瘤模型形成后(Day0)，分別于day0、day2和day4通過尾靜脈注射，分別將0.2 ml PBS(對照組即mock組)、5×106pfu T-01和T-mfIL12注入小鼠體內。day14實驗結束時，T-01組(4000±389 mm3)皮下腫瘤體積明顯小于對照組(mock組，6000±354 mm3)，而T-mfIL12組(2100±930 mm3)又明顯小于T-01組，從day7到day14，3組間均有明顯統計學意義(P<0.001，t-test)。

2.2 靜注T-mfIL12溶瘤病毒可明顯延長腦腫瘤小鼠生存期

T-mfIL12組(平均生存期19±6.64天)與對照組mock組(平均14±3.94天)相比明顯延長，有統計學意義(P<0.05)，但與T-01組(平均18±7.25天)相比生存期無明顯延長(P>0.05)，T-01組與mock組之間也沒有統計學意義(P>0.05)。所有死亡小鼠經解剖均明確證實有腦腫瘤生長(圖2)。

2.3 靜注投藥皮下腫瘤內溶瘤病毒含量明顯高于其他臟器

為了探討靜脈投藥溶瘤病毒在小鼠體內臟器分布情況，在小鼠皮下腫瘤模型3次治療結束后day 5，我們利用real-time PCR對各臟器內病毒含量進行測定。結果發現皮下腫瘤內溶瘤病毒含量最高，平均達1031pfu/mg，而肺、肝、脾、腎和腦內病毒平均含量僅為100-300 pfu/mg左右，明顯低于皮下腫瘤內病毒含量。

圖2 A/J小鼠腦腫瘤模型建立(day0)后，于第5、7、9天，通過尾靜脈注射HSV-1溶瘤病毒治療3次(同皮下腫瘤模型)。T-mfIL12組(■)與對照組mock組(Δ)相比生存期明顯延長(P<0.05)，但與T-01組(●)相比生存期無明顯延長(P>0.05)，T-01組與mock組之間也沒有統計學意義(P> 0.05)。

2.4 靜注T-mfIL12溶瘤病毒明顯促進IFN-γ分泌表達

皮下腫瘤模型靜注治療1次后小鼠釆血測定發現，T-mfIL12組血清中IL-12表達量為518 pg/ml，而其他2組未發現IL-12表達。同時T-mfIL12組血清中IFN-γ表達高達3989pg/ml，T-01組中IFN-γ表達為174 pg/ml，mock組最少僅為115 pg/ml。結果說明靜脈投藥，T-mfIL12可有效分泌表達IL-12，而IL-12又可顯著促進血清中IFN-γ表達，達到抗腫瘤目的。

3 討論

溶瘤病毒(oncolytic virus)療法，是近些年來國際上惡性腫瘤治療研究的熱點之一。已應用臨床研究的主要有I型單純皰疹病毒(HSV-1)、腺病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、呼腸孤病毒和牛痘病毒等[6，7]。HSV-1與其他病毒相比，具有很多優勢和特點：①能感染幾乎人類的所有細胞，宿主范圍廣；②能以較低病毒滴度感染殺死腫瘤細胞，且病毒復制周期短，僅需9到18小時便可產生大量子代病毒有效裂解腫瘤細胞；③與腫瘤選擇性有關的多個病毒復制非必需基因已被證明，有利于病毒載體的改造；④病毒基因組大(152Kb)，允許攜帶較長或多個外源目的基因；⑤病毒感染后可誘導機體產生長效的CD4+T細胞和CD8+T細胞抗腫瘤免疫應答；⑥安全性較高，病毒感染后并不整合到宿主細胞基因組中，而且已研制出多種有效抗皰疹病毒藥物；⑦HSV-1 病毒療法與現有放化療并不拮抗，聯合應用還可增強療效[8]。

基因改造溶瘤病毒主要集中于與病毒病原性和DNA合成酶有關基因。代表性第二代HSV-I溶瘤病毒G207改造2個位點，一是敲除γ34.5基因，正常細胞感染HSV-I病毒后，細胞中雙鏈RNA依賴蛋白激酶(PKR)磷酸化，包含病毒的蛋白質合成被阻斷，γ34.5基因產物可拮抗這種PKR磷酸化，而合成病毒蛋白質，缺失γ34.5基因的HSV-1在正常細胞中不能復制增殖，但癌細胞本來的PKR活性低下，因此缺失γ34.5基因的HSV-1可在癌細胞中增殖。二是將lacZ插入ICP6編碼區，使病毒復制關鍵酶之一核糖核苷酸還原酶(RR)失活，HSV-1不能在正常細胞中復制，但在增殖旺盛的癌細胞中，RR活性明顯上升，可以代償提供給RR已失活的HSV-1，使其復制增殖。通過以上基因改造，HSV-I溶瘤病毒就可以特異性選擇在惡性腫瘤細胞中增殖。與只改造一處基因位點的第一代HSV-I溶瘤病毒相比，靶向性和安全性得到了很大的提高，因為病毒在細胞中復制增殖過程中回復到野生型病毒可能性大大降低。第三代溶瘤病毒G47Δ將G207的Δ47基因敲除，使感染細胞MHC-I表達明顯增高，從而使腫瘤抗原呈遞和抗腫瘤免疫性大大增加，研究證實G47Δ復制殺傷腫瘤細胞能力較G207顯著提高[2,8]。本研究使用HSV-I溶瘤病毒如前文所述由G47Δ衍生而來。

目前國內外應用HSV-I溶瘤病毒主要通過瘤內注射，雖可使病毒最大限度在腫瘤細胞中增殖且不易發生擴散，但對很多深部腫瘤如顱內腫瘤，則存在諸多不便[9]。雖然現在神經導航和神經外科立體定向技術發展迅速，準確性和安全性有充分的保證，但在臨床實際工作中，反復多次向顱內、特別是深部膠質瘤內直接注射投藥，易引起腫瘤出血，也大大加重病人痛苦。本研究首先在小鼠皮下腫瘤模型上，探討HSV-I溶瘤病毒經靜脈注射投藥的抗腫瘤效果。結果發現，T-01治療組中腫瘤體積明顯小于對照組(mock)，有明顯的統計學意義(P<0.001)。而且通過表達IL-12還可顯著增強抗腫瘤效果(T-mfIl12 vs T-01：P<0.001，圖1)。利用real-time PCR對各臟器內病毒含量測定發現，皮下腫瘤內病毒含量(平均1031 pfu/mg)明顯高于肺、肝、脾、腎和腦等臟器(平均含量僅為100-300 pfu/mg)。這說明靜脈注射方式用藥，HSV-I溶瘤病毒可到達并進入腫瘤內部，且特異性選擇在惡性腫瘤內大量復制增殖，進而裂解殺傷腫瘤細胞。其次，小鼠腦腫瘤模型治療結果發現，只是T-mfIL12組的生存期與對照組相比有明顯的延長(P<0.05)，T-01組與對照組比沒有統計學意義(P>0.05，圖2)。我們考慮有以下原因：①病毒靜注投藥可能很難通過血腦屏障；②模型建立后第5、7、9天治療3次，第11天小鼠出現死亡，治療開始時間可能過晚，溶瘤病毒還未充分起效。同時我們沒有發現因靜注溶瘤病毒出現小鼠體重明顯下降和神經毒性反應，說明病毒經靜脈投藥安全性有保障，提示我們未來病毒靜脈注射方式投藥，可能應用于神經外科臨床工作中。

研究證明HSV-I溶瘤病毒可激起抗腫瘤免疫反應，受此啟示人們將免疫治療基因插入到病毒中以增強抗腫瘤效果。病毒在腫瘤細胞內增殖擴增過程中，不斷分泌表達免疫因子，與普通質粒相比目的基因表達量高出數倍至數百倍。目前臨床研究工作中IL-12被認為是最有效的抗腫瘤因子，它可以激活NK細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞、促進DC成熟、抑制血管形成等[11,12]。可誘導產生干擾素-γ(IFN-γ)和其它免疫因子，表現出強大抗腫瘤效果。本研究證實，靜脈注射表達IL-12的溶瘤病毒可有效表達IL-12，并且IL-12可誘導產生大量的IFN-γ，能顯著增強HSV-I的抗腫瘤效果。有研究證實靜注HSV-I溶瘤病毒可產生抗HSV-I抗體，我們前期研究工作證實抗HSV-I抗體可減弱靜脈注射病毒的療效，但有研究顯示提高注射病毒劑量可拮抗這種作用。

總之，我們研究證實靜脈注射HSV-I溶瘤病毒，可有效進入腫瘤內并裂解殺傷腫瘤細胞，同時病毒還可激起抗腫瘤免疫反應，IL-12可顯著增強抗腫瘤免疫反應。研究證實HSV-I溶瘤病毒和現行的放化療治療并不拮抗，聯合用藥可明顯增強療效[8,13,14]。隨著研究進一步深入，HSV-I溶瘤病毒經靜脈注射用藥可能應用于神經外科治療膠質瘤工作中，將大大拓寬其臨床使用范圍和提高應用價值。我們相信HSV-I溶瘤病毒在治療惡性腦腫瘤工作中會有美好的發展前景。

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