六種注射用交聯透明質酸鈉的形態學觀察及體外酶降解實驗

王慕瑤，蔣伊晨，吳可倫，謝 利，王 杭

（四川大學華西口腔醫學院頜面外科 四川 成都 610041）

?基礎研究?

六種注射用交聯透明質酸鈉的形態學觀察及體外酶降解實驗

王慕瑤，蔣伊晨，吳可倫，謝 利，王 杭

（四川大學華西口腔醫學院頜面外科 四川 成都 610041）

目的：體外對比瑞藍2、喬雅登、艾麗薇、潤百顏、伊婉和海薇6種HA產品的形態及酶解反應時間。方法：取6種HA各0.050ml，經2%甲苯胺藍染色12h，水溶液狀態下分別于肉眼和顯微鏡下觀察其形態；HA染色后室溫條件下（24℃）置于300U（150U/ml）透明質酸酶中溶解，顯微鏡下觀察溶解狀態，并記錄溶解時間。結果：6種HA均能觀察到顆粒狀形態，不同HA顆粒大小及分布均有所差異，其在透明質酸酶中完全溶解所需時間也不相同。結論：盡管不同HA產品相類似，但其因交聯技術、制造工藝的不同，物理性質有一定差異，這種差異會在一定程度上影響其酶解反應速度。

皮膚填充劑；透明質酸；透明質酸酶；酶解作用；不良反應

隨著醫療整形美容行業的興起，透明質酸（hyaluronic acid，HA）類皮膚美容填充劑已廣泛應用于頜面部微創整形。盡管HA類填充產品相類似，但不同產品的交聯方法和生產工藝不盡相同，這使得HA凝膠的物理性質，如：濃度、交聯度、顆粒大小、硬度、凝聚性等有所差異，這些差異會在臨床應用中有所體現。透明質酸酶（hyaluronidase，HAase）是以降解透明質酸為主的糖苷酶，可在一定程度上糾正HA注射后造成的不良反應。本實驗欲探究6種國內外常用的HA類皮膚美容填充產品的外觀形態，并于體外對比其在 HAase 中降解所需時間。

1 材料和方法

1.1 實驗材料：6種HA產品：瑞藍2（Restylane 2，瑞典高德美公司）、喬雅登（Juvéderm Ultra 3，法國艾爾建公司）、伊婉（Yvoire contour plus，韓國LG生命科學）、艾麗薇（Elravie deep line plus，韓國 Humedix 公司）、潤百顏（BioHyalux，山東濟南華熙福瑞達生物醫藥有限公司）和海薇（Matrifill，上海其勝生物制劑有限公司）；注射用玻璃酸酶（上海第一生化藥業公司，1 500U/支）。

1.2 方法

1.2.1 凝膠形態學檢查：取凝膠樣本50μl置于直徑3cm的培養皿中，經25μl的甲苯胺藍（2%）染色10min后，加入2ml蒸餾水將其稀釋，被稀釋的凝膠儲存于4℃冰箱中，12h后取出，分別于裸眼及顯微鏡下觀察6種HA產品的形態結構。

1.2.2 酶溶解實驗：酶解實驗前，經染色的凝膠提前置于室溫下1h，再溶解于300U HAase溶液中（150U/ml），混勻，立即于顯微鏡下觀察凝膠的酶溶解狀況，記錄酶溶時間。實驗過程中室溫為24℃，每種凝膠產品進行3次重復實驗。

2 結果

2.1 HA產品的形態學檢查結果：6種HA產品溶于水中觀察，可見顆粒大小不一、形態不規則。6種HA產品濃度不同，顆粒尺寸均有其相應范圍，見表1。裸眼觀察下，不同凝膠形態學有較大差異（如圖1）：瑞藍、伊婉、潤百顏和海薇的顆粒形態明顯且無粘性，而喬雅登、艾麗薇呈均質狀，顆粒形態不明顯；瑞藍顆粒分布均勻，伊婉顆粒尺寸最大，潤百顏、海薇顆粒形態相似。顯微鏡下結果所示（如圖2），不同種凝膠形態差異更加明顯：瑞藍凝膠顆粒呈長方形，形態相對規則；潤百顏及海薇顆粒形態相類似，呈方形狀，且潤百顏顆粒直徑略大于海薇；喬雅登與艾麗薇在顯微鏡下可見細小顆粒狀凝膠，且顆粒間緊密相靠，其中喬雅登可見較大顆粒狀凝膠且顆粒直徑分布范圍較艾麗薇廣。顯微鏡下的觀察證實了此6種HA產品均有粒子特性。

表1 六種HA濃度、顆粒直徑范圍及酶解反應時間比較

圖1 六種HA產品甲苯胺藍染色后裸眼下形態學觀察比較

2.2 HA酶溶解時間檢測：在相同條件下：室溫24℃，HAase 300U（150U/ml），6種HA產品溶解時間結果見表1。顯微鏡下可直觀連續地觀察HA的溶解狀態（圖3～8）：其中喬雅登溶解較快，但個別大顆粒狀的喬雅登完全溶解需

圖2 六種HA 產品甲苯胺藍染色后顯微鏡下形態觀察

注：(a)瑞藍 2（Restylane 2）；(b) 伊婉（Yvoire contour plus）；(c) 潤百顏（BioHyalux）；(d) 喬雅登（Juvéderm Ultra 3）；(e) 艾麗薇（Elravie deep line plus）；(f) 海薇（Matrifill） 60～90min，瑞藍和艾莉薇在90min內可完全溶解，伊婉、潤百顏、海薇在90min內溶解不明顯。

圖3 瑞藍 2（Restylane 2）酶解反應顯微鏡下觀察

圖4 喬雅登（Juvéderm Ultra 3）酶解反應顯微鏡下觀察

3 討論

圖5 伊婉（Yvoire contour plus）酶解反應顯微鏡下觀察

圖6 艾麗薇（Elravie deep line plus）酶解反應顯微鏡下觀察態觀察

圖7 潤百顏（BioHyalux）酶解反應顯微鏡下觀察

圖8 海薇（Matrifill）酶解反應顯微鏡下觀察

HA 是廣泛存在于生物體內的一種酸性黏多糖，在不同物種和組織中其化學結構相同。正是由于HA 良好的生物相容性及其獨特的物理特性，使其自問世以來，成為理想且常用的皮膚填充材料。HA可被 HAase 降解，普通HA在體內很快就會代謝成水和二氧化碳，不同組織中的HA半衰期不同，從幾分鐘（血液中）到3周不等，在皮膚中其半衰期不到1d[1]。作為皮膚填充劑使用時，為了延長療效，一般采用交聯的方法改變HA鏈的三維結構，以延緩其降解速度。經過交聯的HA產品，維持效果約6～9個月，部分產品的療效可維持1～2年。

3.1 HA的物理特性：HA產品的原材料是純度相同，但分子量不同的HA粉末。交聯后的HA產品因其交聯技術及濃度不同而有所差異。在醫學美容領域常用1,4-丁二醇二縮水甘油醚（1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE）作為交聯劑[2]。實驗中我們觀察到不同種HA產品形態明顯不同，瑞藍、伊婉、海薇、潤百顏與喬雅登、艾麗薇相比有更明顯的顆粒狀形態，這是因為它們的交聯技術有所區別。以瑞藍和喬雅登為例，雖然兩者使用的交聯劑均為BDDE，但瑞藍采用的是NASHA?交聯技術，其先進行分子交聯工藝，制成透明質酸固塊，再進行粉碎切割工藝，最后通過直徑不同的篩網分選工藝，將顆粒按不同直徑，分為不同臨床應用的產品線。因此 NASHA? 工藝主要特點是顆粒形態明顯，硬度大，直徑均一，而極少量從交聯HA 顆粒上自然脫落下來的游離透明質酸，又能使產品更易推注，優化臨床效果，常被稱為雙相 HA。而喬雅登采用的是Hylacross?交聯技術，形成具有3D矩形解構和均質化的HA，并且未添加未交聯的HA，常被稱為單相HA，因此喬雅登沒有特定的顆粒尺寸大小。但Ohrlund等學者的研究發現在鏡下喬雅登仍有顆粒狀形態，且與瑞藍相比，喬雅登的顆粒直徑范圍更廣[3-4]；Flynn等學者的研究也證明所有HA凝膠產品均存在低分子量HA[5]；與本研究結果相一致。

除了顆粒形態外，HA還有一些其他重要的物理特性，如交聯度、凝聚性、分子量、流變性能等。這些物理性質間相互影響且賦予HA獨特的機械性能。例如，交聯度決定了凝膠的硬度，即對抗形變的能力，凝膠交聯度越高，硬度越大。其中硬度可以通過測量凝膠流變性能所體現。此外，HA的顆粒形態也在一定程度上影響其機械性能，不規則形態的顆粒可能比球形顆粒更易聚集互鎖，使得凝膠均勻一致。這些特性最終會影響HA的適用范圍、注射技術及最終效果[6]。

3.2 HA在臨床上的應用：對臨床醫生來說，了解掌握HA類皮膚填充劑的特性，是滿足病人不同訴求，從而達到理想治療效果的必要條件。HA物理性質多與其臨床注射效果、維持時間和抵抗酶降解相聯系。

已有研究表明HA產品的持久性與HA的濃度和交聯度呈正相關，但濃度高于25mg/ml的HA產品很難通過小口徑針頭注射[7-8]，這也就阻礙了高濃度HA的開發應用。顆粒大小與形態是HA的一個重要物理性質，采用不同專有篩生產工藝或均質化生產工藝生產的HA產品，凝膠平均顆粒大小明顯不同，大顆粒產品更適用于填充深層組織。HA顆粒大小與HA抵抗酶降解之間也存在一定的關系：大顆粒HA總表面積有限，限制了HAase對HA的溶解破壞；相反，小顆粒HA提供了更多總表面積，使其更容易降解。以往臨床研究指出，雖然不同種HA產品的顆粒直徑大小不同，但大顆粒HA產品并未顯示出更長的臨床持續效果，一種解釋是可能其顆粒直徑差別還不足以產生臨床效果差異[8]。但隨著HA生產技術的革新，HA類產品的豐富，一些廠商已推出同類型產品的大顆粒型號產品，如大顆粒型艾麗薇、大顆粒型伊婉，其臨床維持效果也隨著顆粒直徑范圍的擴大而增長。但值得注意的是，HA填充劑的注射效果不僅與HA填充劑的特性相關，還與注射技術及求美者生物差異相關。因此綜合各種因素的影響，HA物理特性的區別可否在臨床上有所體現也存在一定爭議[9]。但無論如何，不同HA產品的區別為求美者提供了更精密和多元化的治療效果。

在臨床治療中，HA填充產品抵抗內生性HAase的降解，保持長期塑形效果很重要，但HA的安全性、易使用性及求美者的舒適度等因素也同樣是評估產品的重要指標。尤其隨著HA的流行，注射后不良反應的報道也越來越多。常見的不良反應包括腫脹、疼痛、紅斑等，一般2周內可自愈。偶爾還會出現過敏反應，肉芽腫形成。而因血管栓塞造成的皮膚壞死和失明是最嚴重的不良反應，也是臨床上最難應對的[10-13]。治療HA注射后所造成的組織壞死和失明是近年來的研究熱點[14]，雖然其治療方法多樣，但 HAase的注射仍是最為重要的[15-17]。因此，探究不同種HA產品的酶溶解速度也顯得更為有意義。回顧以往研究，HAase降解HA的測定方法有色譜分析法、黏度測定法、比色測定法等[1,9,18-19]，這些方法大多復雜耗時，或者需要精密昂貴的儀器。本研究在顯微鏡下觀察對比6種HA填充產品的形態和HAase降解過程，為探究不同種HA產品的顆粒形態分布和體外酶降解時間提供了一個簡單、易行、直觀和重復性強的方法。值得注意的是，HA的注射后的持久性和抵抗酶降解反應并不是完全等同的概念。臨床治療中HA持久性主要體現在HA的體積保有率，其不但與HA抗酶解能力相關聯，還與HA的支撐能力密切聯系。

顯微鏡下我們發現6種HA產品的酶溶解所需時間不同。其中伊婉抗酶降解能力最強，其次是潤百顏、海薇和瑞藍，而喬雅登和艾麗薇酶溶解所需時間較短。Sall和Delorenzi等學者的研究發現體外喬雅登比瑞藍抗降解能力更強，可能的原因是瑞藍作為一種雙相HA產品，與單相HA喬雅登相比，其不同的顆粒形態為酶解反應特供了更大的表面積[18,20]。也有研究指出，可能因喬雅登具有更高的濃度和更強的凝聚性，使得其抗降解能力更強。因為HA抵抗酶降解與其凝聚特性也存在一定關系，凝聚力使HA形成了一個緊密完整的三維網架，限制HAase的滲透和對HA的降解，是HA保持完整的重要因素[19]。相反，Park等研究者的體外實驗則證明雙相HA凝膠抵抗酶降解能力更強[9]，本研究也發現體外溶液狀態下喬雅登在HAase中溶解所需時間更短，可能是由于溶液狀態下凝聚力對HA酶降解的影響很小而無法完全模擬體內情況。這是本實驗的缺陷，但研究結果也進一步顯示凝聚力在HA抗降解能力方面可能是一個重要因素。此外，體外實驗結果提示臨床醫生和研究者，在體內較復雜的環境下以HAase溶解HA，尤其是想要溶解血管內的HA，所需要的時間可能更長，且不同種HA產品的溶解時間差異可能更大。這就要求臨床醫生應充分了解不同HA產品的物理性質，選擇合適的產品進行注射治療，并針對不同種HA產品所造成的不良反應調整治療策略。相關問題也需要更多的體內外實驗研究提供科學依據，以便指導臨床醫生針對不同HA產品進行更加安全有效的治療。

（致謝：感謝高德美公司對本項目的支持。）

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Morphological Comparison and Enzymatic Degradation Prof i le of Six Hyaluronic Acid Dermal Fillers

WANG Mu-yao,JIANG Yi-chen,WU Ke-lun,XIE Li,WANG Hang
(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China)

Objective To compare the size and shape of particles and enzymatic degradation prof l le in six hyaluronic acid (HA) dermal fl ller products.Methods Six HA dermal fl ller products were studied using staining by toluidine blue, in combination with microscopy. About 0.050 ml of sample was added into a 3cm merit dish containing 2 ml of water and 25 μl of 2% toluidine blue solution. The particles were allowed to stain for about 12 hours before being observed in a microscope. The hyaluronic acids were also exposed to hyaluronidase and photographed at different time points to determine degradation time.Results The microscopic observation confirmed that all the studied filler products contained particles and showed a differentiation in particle size and distribution between the six products. Degradation time differences among all 6 products. Conclusion Although the HA fl llers appear to be similar, their methods of cross-linking technique and manufacture are not the same. Their different ability of resistance to enzymatic degradation is concerned with their physical properties.

dermal fl llers;hyaluronic acid;hyaluronidase;enzymolysis;hyaluronic acid complications

Q946

A

1008-6455（2017）04-0052-04

2017-1-15

2017-04-05

編輯/張惠娟

王杭，女，教授，碩士生導師；四川大學華西口腔醫院醫療美容科主任，口腔頜面外科學系副主任；E-mail:dr.hangwang@gmail.com