NSCLC中AEG-1的表達及與臨床病理特征和血管生成的關系研究

馬志紅 陳瑩蓉 董順利 徐旭婷 劉進 宋鵬濤 李鴻偉 戴利成

NSCLC中AEG-1的表達及與臨床病理特征和血管生成的關系研究

馬志紅 陳瑩蓉 董順利 徐旭婷 劉進 宋鵬濤 李鴻偉 戴利成

目的 通過分析星形膠質細胞上調基因-1（AEG-1）在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達，探討其與臨床病理特征和血管生成的關系。方法 選取NSCLC患者手術切除標本92例，每例標本均留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上的配對遠端正常組織，采用免疫組織化學染色方法評估AEG-1表達和微血管密度（MVD），比較腫瘤組織AEG-1高表達和低表達患者臨床病理特征及腫瘤組織MVD。 結果 NSCLC腫瘤組織AEG-1高表達55例（59.78%），遠端正常組織AEG-1高表達7例（7.61%），兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。AEG-1高表達患者與AEG-1低表達患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統計學差異（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結轉移等比較均有統計學差異（均P＜0.05）。腫瘤組織MVD高于遠端正常組織（P＜0.05）。AEG-1高表達患者腫瘤組織MVD高于低表達患者（P＜0.05）。 結論 AEG-1在NSCLC發生、發展中起重要作用，并與腫瘤血管生成密切相關，靶向抑制NSCLC患者AEG-1的表達可能是抗腫瘤治療的有效途徑。

AEG-1 非小細胞肺癌 血管生成 微血管密度 免疫組織化學

肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。據統計，2015年我國新發肺癌患者約733 300例，因肺癌致死患者約610 200例[2]，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%[3]，患者5年生存率低。研究表明，血管生成在NSCLC的發生、發展過程中起重要作用，通過抑制血管生成可明顯延緩腫瘤細胞的增殖、擴散和轉移。因此，尋找新的抗血管生成治療靶標是NSCLC靶向治療的新突破口。星形膠質細胞上調基因-1（AEG-1）在HIV-I感染或TNF-α誘導的人胚胎星形細胞中的表達上調[4]，被認為是與腫瘤發生、發展相關的癌基因。本研究采用免疫組織化學方法檢測NSCLC腫瘤組織和遠端正常組織中AEG-1的表達，分析其與腫瘤臨床病理特征和血管生成的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年1月至2016年12月本院收治的92例原發性NSCLC患者的手術切除標本，每例標本均留取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上的配對遠端正常組織，甲醛溶液固定后常規石蠟包埋，4μm連續切片用于組織學檢查和免疫組織化學分析。患者均經病理學檢查確診NSCLC，臨床資料完整，術前未接受放化療。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色 將組織石蠟切片置于65℃烤箱孵育2 h后常規脫蠟水化，參照Polymer雙染檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號DS-0006）說明書進行免疫組織化學操作。切片經3%H2O2室溫孵育10min后采用高壓修復法進行抗原修復（pH6.0的0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓3min）。接著，以等比例羊抗人單克隆抗體AEG-1（英國Abcam公司，批號ab124789，1∶300）和兔抗人單克隆抗體CD105（英國Abcam公司，批號ab11414，1∶200）4℃孵育過夜。次日，滴加適量等比例的辣根酶標記山羊抗小鼠IgG聚合物與堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG聚合物的混合液，覆蓋組織，孵育30min，最后用DAB和玖紅顯色劑分別顯色5～8min，蘇木素復染、脫水、透明后封蠟。

1.3 AEG-1表達評估 根據陽性染色腫瘤細胞的比例和染色強度評估。腫瘤細胞比例：無陽性腫瘤細胞計0分，≤10%計1分，10%～50%計2分，＞50%計3分。染色強度：無染色計0分，弱染色（淺黃色）計1分，中等染色（黃棕色）計2分，強染色（棕色）計3分。細胞比例計分×染色強度計分數為總分，總分0～3分視為AEG-1低表達，總分4～9分視為AEG-1高表達。

1.4 微血管密度（MVD）評估 采用血管內皮標記物CD105染色方法評估NSCLC腫瘤組織的MVD。任何與相鄰的微血管、腫瘤細胞和結締組織明顯分開的被染成紅色的內皮細胞或內皮細胞簇均視為單個計數血管。由2位計數者同時計算200倍放大視野（0.74mm2）下血管最多區域的血管數量，取5個視野的平均值作為MVD。

1.5 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 NSCLC腫瘤組織和遠端正常組織中AEG-1表達免疫組織化學染色所見 見圖1。

圖1 N S C L C腫瘤組織和遠端正常組織中A E G-1表達情況免疫組織化學染色所見（a：遠端正常組織；b：腫瘤組織；免疫組織化學染色，×2 0 0）

由圖1可見，AEG-1陽性染色主要位于細胞質、核膜和細胞連接處。在遠端正常組織中AEG-1染色缺失或弱染色；在NSCLC腫瘤組織中AEG-1中等染色，呈黃棕色。NSCLC腫瘤組織 AEG-1高表達 55例（59.78%），遠端正常組織AEG-1高表達7例（7.61%），兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 NSCLC腫瘤組織中AEG-1高表達與低表達患者臨床病理特征比較 見表1。

由表1可見，AEG-1高表達患者與AEG-1低表達患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統計學差異（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結轉移等比較均有統計學差異（均P＜0.05）。

2.3 NSCLC腫瘤組織和遠端正常組織中MVD比較見圖2。

由圖2可見，CD105陽性染色主要位于微血管內皮細胞的細胞質及細胞膜，呈紅色。在遠端正常組織中CD105表達微弱，MVD為18.59±5.81；在腫瘤組織中CD105陽性表達強烈，MVD為48.39±16.69；兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。AEG-1高表達、低表達患者腫瘤組織MVD分別為54.35±16.20、39.54±13.27，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

AEG-1作為一個致癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達[4-8]，且其高表達水平與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等密切相關。AEG-1與腫瘤血管生成的研究還未透徹。本研究采用免疫組織化學方法觀察NSCLC腫瘤組織中AEG-1的表達，并通過血管內皮標記物CD105探討AEG-1表達與血管生成的關系。

本研究結果顯示，NSCLC腫瘤組織AEG-1高表達率明顯高于遠端正常組織AEG-1高表達率；AEG-1高表達患者與AEG-1低表達患者性別、年齡、是否吸煙、腫瘤大小、腫瘤組織類型、腫瘤位置等比較均無統計學差異，腫瘤TNM分期、分化程度、是否淋巴結轉移等比較均有統計學差異。這表明，AEG-1高表達在NSCLC發生、發展中起重要作用，這與Ke等[9]研究結果相符。

表1 N S C L C腫瘤組織中A E G-1高表達與低表達患者臨床病理特征比較[例（%）]

圖2 N S C L C腫瘤組織和遠端正常組織中M V D比較（a：遠端正常組織；b：A E G-1低表達；c：A E G-1高表達；d：A E G-1高表達與低表達比較；C D 1 0 5染色，×2 0 0）

血管生成是指在原有的血管床上生成新血管的過程，主要包括基質降解、內皮細胞增殖、內皮細胞遷移、血管管腔形成及血管重構等步驟，與腫瘤的發生、發展關系非常密切，抑制血管生成是腫瘤防治的有效途徑。Zhang等[10]研究發現，相比NSCLC遠端正常組織中，腫瘤組織的血管內皮標志物CD34和CD105表達均有明顯上調。Minhajat等[11]研究發現，在肺癌組織中CD105高表達。本研究結果顯示，在遠端正常組織中CD105表達微弱，在腫瘤組織中CD105陽性表達強烈，兩者MVD比較差異有統計學意義；AEG-1高表達患者腫瘤組織MVD高于AEG-1低表達患者。這表明，AEG-1可能參與了NSCLC腫瘤組織血管生成的過程。

綜上所述，AEG-1在NSCLC發生、發展中起重要作用，并與腫瘤血管生成密切相關，靶向抑制NSCLC患者AEG-1的表達可能是抗腫瘤治療的有效途徑。

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[9]Ke Z,Mao X,Zeng C,et al.AEG-1 expression characteristics in human non-smallcelllung cancer and its relationship with apoptosis[J].MedicalOncology,2013,30(1):1-9.

[10]Zhang C,Liu Y,Guo S,et al.Different biomarkers in non-small cell lung cancer in blood vessel invasion[J].Cell biochemistry and biophysics,2014,70(2):777-784.

[11]Minhajat R,Mori D,Yamasaki F,et al.Organ‐specific endoglin (CD105)expression in the angiogenesis of human cancers[J]. Pathology international,2006,56(12):717-723.

Expression of AEG-1 in non-small cell lung cancer and its relation to clinicopathological features and angiogenesis

MA Zhihong,

CHEN Yingrong,DONG Shunli,et al.Huzhou Key Laboratory of Molecular Medicine,Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China

Objective To investigate the expression of astrocyte elevated gene-1(AEG-1)in non-small cell lung cancer (NSCLC)its relation to clinicopathological features and angiogenesis of tumor. Methods Expression of AEG-1,and intratumoral microvessel density (MVD,labeled by CD105)were assessed by immunohistochemistry in 92 NSCLC tissue specimens and corresponding adjacent normal tissue specimens.The relationship of AEG-1 with MVD and clinicopathological features of NSCLC was analyzed. Results The over-expression rate of AEG-1 NSCLC carcinoma tissue was 59.78%(55/92), which was significantly higher than that in adjacent normal tissue(7.61%,7/92)(P＜0.05).Upregulated expression of AEG-1 was significantly associated with clinical stage(P＜0.05),tumor differentiation(P＜0.05),lymph nodes metastasis(P＜0.05),and higher MVD (P＜0.05)in patients with NSCLC. Conclusion The results suggest that AEG-1 may be involved in malignant transformation and tumor angiogenesis in NSCLC,and targeted inhibition of AEG-1 expression might be a novel strategy for treatment of NSCLC.

Astrocyte elevated gene-1 Non-small cell lung cancer Angiogenesis Intratumoral microvessel density Immunohistochemistry

2 0 1 7-0 2-1 6）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2017- 293

浙江省自然科學基金青年項目(LQ 14H 160015)；湖州市公益性技術應用研究一般項目(2013G Y 17，2014G Y B 21)

313000湖州市中心醫院分子醫學重點實驗室（馬志紅、陳瑩蓉、董順利、徐旭婷、戴利成），病理科（劉進、宋鵬濤），心胸外科（李鴻偉）

戴利成，E- m ail：dlc21@ 126.com