高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達的影響研究

聶振禹 洪夢琪 包蓓艷 李國富 陳爭躍 余雄偉

高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達的影響研究

聶振禹 洪夢琪 包蓓艷 李國富 陳爭躍 余雄偉

目的 探討高糖腹膜透析液對人腹膜微血管內皮細胞（HPMECs）中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達的影響。方法 體外培養HPMECs并分為5組，N組用含葡萄糖的無酚紅RPMI-1640培養基培養；P組用2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；GN組用含50g/ml葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）拮抗劑根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；SN組用含10g/ml鈉-葡萄糖共轉運載體1（SGLT1）拮抗劑根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；GN+SN組用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養。分別采用RT-PCR法、Western blot法檢測各組HPMECs GLUT1、SGLT1、細胞因子轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內皮生長因子-A（VEGF-A）、結締組織生長因子（CTGF）的mRNA、蛋白表達水平。 結果 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的mRNA、蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）。 結論 高糖腹膜透析液或通過上調HPMECs中GLUT1、SGLT1的表達，進而上調TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達，從而起促腹膜纖維化作用。

腹膜微血管內皮細胞 葡萄糖轉運蛋白1 鈉-葡萄糖共轉運載體1 細胞因子轉化生長因子-β1 血管內皮生長因子-A 結締組織生長因子

腹膜透析是終末期腎病患者的一種有效治療方法[1]。盡管在過去的幾十年間，透析技術已有很大發展，但腹膜透析患者的生存率仍不理想。腹膜纖維化所導致的超濾衰竭是患者不得不中止腹膜透析的常見原因，而慢性腹膜炎癥及高糖透析液對腹膜的損傷是導致腹膜纖維化的兩個重要原因[2]。腹膜透析相關性腹膜纖維化的發生是一個復雜的病理發展過程[3]，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統、細胞因子轉化生長因子-β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）、結締組織生長因子（CTGF）等發揮的作用，以及內皮細胞中存在的葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）[4]和鈉-葡萄糖共轉運載體1（SGLT1）[5]也與這一過程密切相關。GLUT1與SGLT1在各種細胞中抗纖維化方面的作用受到臨床關注[6-7]。本研究擬通過體外培養人腹膜微血管內皮細胞（HPMECs），探討高糖腹膜透析液對HPMECs中GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF表達的影響，以期為探討腹膜纖維化的發生機制及治療靶點提供新的理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 改良型PMI-1640培養基（美國Hyclone公司）；無酚紅RPMI-1640培養基、0.25%EDTA-胰蛋白酶、FBS（美國Gibco公司）；2.5%葡萄糖腹膜透析液（廣州百特醫療有限公司）；根皮素、根皮苷原粉（美國Sigma公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；GoTaq兩步法RT-qPCR系統、GoScript逆轉錄酶系統、GoTaqRqPCR Master Mix（美國Promega公司）；Trizol試劑（美國Ambion公司）；兔抗人GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF抗體（美國Santa Cruz公司）；熒光標記的羊抗兔Ⅱ抗（美國LICOR公司）；BCA法蛋白定量試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；HPMECs由寧波大學潤良糖尿病研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將HPMECs接種在1%明膠包被的25cm2培養瓶中，置于37℃、5%二氧化碳的培養箱中培養，24～36h后第1次換液，以后每2～3d換液1次。當細胞生長融合至80%～90%時，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養，取第3、4代用于實驗。

1.2.2 實驗分組 將細胞分成5組：N組用含葡萄糖的無酚紅RPMI-1640培養基培養；P組用2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；GN組用含50g/ml GLUTI拮抗劑根皮素的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；SN組用含 10g/ml SGLT1拮抗劑根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養；GN+SN組用含50g/ml根皮素和含10g/ml根皮苷的2.5%葡萄糖腹膜透析液培養。

1.2.3 RT-PCR法檢測GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGFA、CTGF mRNA表達水平 當細胞生長融合至90%～95%時，按上述分組要求同步培養細胞48h，采用Trizol一步法抽提細胞總RNA，用GoScript逆轉錄酶系統試劑盒合成cDNA，產物用GoTaq兩步法RT-qPCR系統試劑盒進行PCR擴增。PCR反應條件為95℃10s，95℃30s，60℃ 60s，72℃ 60s，共40個循環，采用2-△△Ct法分析RT-PCR結果，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot法檢測 GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達水平 當細胞生長融合至90%～95%時，按上述分組要求同步培養細胞48h，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，取50g變性蛋白進行SDS聚丙烯胺凝膠電泳，并用0.22m的硝酸纖維素濾膜進行蛋白質轉膜，考馬斯亮藍染膠、麗春紅S染液染膜，觀察蛋白質是否轉移完全。用含5%牛血清白蛋白的封閉液進行封閉，Ⅰ抗（1∶500）4℃孵育過夜，隨后熒光標記的羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000）室溫避光孵育1h，Licor Odyssey紅外成像系統掃描實驗結果，最后分析各目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值作為蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達水平比較 見圖1。

圖1 5組H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F-β1、V E G F-A、C T G F m R N A表達水平比較

由圖1可見，5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組 HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF mRNA表達水平均降低（均P＜0.05）。

2.2 5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達水平比較 見圖2。

圖2 5組H P M E C s G L U T 1、S G L T 1、T G F β-1、V E G F-A、C T G F蛋白表達水平比較

由圖2可見，5組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達水平比較均有統計學差異（均P＜0.05）。與N組比較，P組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；與P組比較，GN組、SN組、GN+SN組HPMECs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）。

3 討論

目前國內腹膜透析常規使用不同濃度葡萄糖為滲透劑的乳酸鹽透析液。高糖在腹膜內異常代謝所產生的晚期糖基化終產物或葡萄糖降解產物可促進細胞外基質的分泌、沉積，最終導致腹膜纖維化，其中葡萄糖的吸收可能隨治療時間的延長而增加。葡萄糖的吸收會導致滲透梯度的減小或消失加快，超濾量減少，同時可能導致高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥、高血壓、體重增加等代謝紊亂。因此獲得最佳超濾以及減少對腹膜功能損傷的同時，減少葡萄糖的吸收，進而減少代謝紊亂是腹膜透析治療的理想目標。高糖所致的細胞損傷、代謝紊亂，細胞內糖攝入過多是啟動因素。

高糖必須借助葡萄糖轉運蛋白進入細胞內才能發揮其毒性作用。細胞對葡萄糖的吸收攝取途徑有兩種[8-9]：一是載體介導的易化擴散，二是繼發性主動轉運，通過鈉泵的存在，促進葡萄糖逆濃度梯度轉運。其中易化擴散轉運的主要載體是GLUT，而繼發性主動轉運主要依靠SGLT介導。GLUT是細胞轉運葡萄糖的載體，是調控細胞糖代謝的第一道關卡。GLUT功能異常勢必會影響細胞內糖代謝，從而導致代謝紊亂。研究發現，GLUT有很多亞型，包括GLUT1、2、3、4、5等，而SGLT主要有SGLT1、2、3。據報道，在人視網膜的血管內皮細胞上存在著GLUT1、3，在體外培養的HPMCs上有3種GLUT。其中GLUT1是介導HPMCs葡萄糖攝取的主要轉運蛋白，高糖可上調間皮細胞上GLUT1蛋白的表達。而GLUT1表達上調或者活性增加使細胞對葡萄糖攝取過多，造成細胞內糖負荷過重和糖代謝紊亂，進而導致腹膜損傷、細胞外基質沉積，加重腹膜炎癥，最終導致腹膜纖維化。同時其表達上調將增加HPMCs對葡萄糖的攝取，降低超濾率[10-11]。高糖對不同細胞上的GLUT的作用是不同的：在視網膜周細胞中，它可以降低GLUT的轉運活性而在內皮細胞沒有這種功能[12]，同時GLUT位置的改變會導致功能的改變[13-14]。本研究發現2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促進HPMCs GLUT1、SGLT1表達水平升高，而在GLUT1拮抗劑與SGLT1拮抗劑作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1表達中水平降低。

既往研究發現，肺的成纖維細胞中GLUT的表達對肺纖維化有一定影響[15]。本研究發現2.5%葡萄糖腹膜透析液可以促進HPMCs纖維化相關因子TGF-β1、VEGFA、CTGF表達水平升高，而在GLUT1拮抗劑與SGLT1拮抗劑作用下，HPMCs TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達水平降低。這表明在下調HPMCs GLUT與SGLT1表達水平后，TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達水平也下調。

根皮素主要存在于蘋果樹的樹皮、樹葉以及果實中。正如大多數黃酮類化合物一樣，研究發現根皮素具有多種藥理作用，如抗氧化、免疫抑制、調節糖在體內的轉運從而起到降血糖的作用，并在調節細胞增殖、凋亡等細胞周期也有一定的作用，因此可作為GULT1的拮抗劑使用[16]。根皮苷具有降低血糖、改善記憶力、抗氧化、抗癌等多種重要的生物活性，在新型藥物和天然保健食品開發中具有廣泛的應用前景，同時也是SGLT1的一種拮抗劑[17]。本研究結果顯示，根皮素和根皮苷均可下調HPMCs中 GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達水平。

綜上所述，本研究通過體外實驗觀察高糖腹膜透析液對HPMCs GLUT、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF表達的影響，發現2.5%葡萄糖腹膜透析液可以上調HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達水平；而在根皮素與根皮苷作用下，HPMCs GLUT1、SGLT1、TGF-β1、VEGF-A、CTGF的表達水平均下降。然而GLUT1、SGLT1對HPMCs的具體調控機制較為復雜，還有待更進一步深入研究。

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Expression of GLUT1,SGLT1,TGFβ-1,VEGF-A,CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells cultured with high

glucose peritoneal dialysis fluid

NIE Zhenyu,HONG Mengqi,BAO Beiyan,et al.Department of Nephrology,Ningbo Vrology and Nephrology Hospital,Ningbo 315192,China

Objective To investigate the effect of high glucose-based peritoneal dialysis fluid(PDF)on the expression of glucose transporters1(GLUT1),Na+/glucose cotransporters1(SGLT1),transforming growth factor-β1(TGF-β1),vascular endothelial growth factor-A(VEGF-A)and connective tissue growth factor(CTGF)in human peritoneal microvascular endothelial cells(HPMECs). Methods The cultured HPMECs were divided into 5 groups:normal group(N),peritoneal dialysis(containing 2.5%glucose)group(P);GLUT1 antagonists group(GN),SGLT1 antagonists group(SN);GLUT1 antagonists+SGLT1 antagonists group(GN+SN).The mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in HPMECs were detected by RT-qPCR and Western blotting,respectively. Results There were significant differences in mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF among 5 groups(P＜0.05).Compared with group N,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in group P was increased significantly(P＜0.05).Compared with group P,the mRNA and protein expression of GLUT1,SGLT1,TGF-β1,VEGF-A and CTGF in groups GN,SN and GN+SN was decreased significantly(P＜0.05). Conclusion High glucose peritoneal dialysis fluid may up-regulate the expression of GLUT1, SGLT1,which may further induce the up-regulating expression of TGF-β1,VEGF-A and CTGF in human peritoneal microvascular endothelial cells,resulting in the peritoneal fibrosis.

Peritoneal microvascular endothelial cells Glucose transporters1 Na+/glucose cotransporters1 TGF-β1 VEGF-ACTGF

2 0 1 6-1 0-2 0）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1678

浙江省自然科學基金資助項目（Y13H050021）；寧波市科技計劃項目（2015C50001）；寧波市鄞州區科技計劃項目（鄞科[2011]69號-26）

3 1 5 1 9 2 寧波市泌尿腎病醫院腎內科（聶振禹、包蓓艷、李國富、陳爭躍、余雄偉）；寧波大學醫學院（洪夢琪）

包蓓艷，E- m ail：baobeiyan2007@ sina.com