BIIB021對MDS細胞株Skm-1增殖的多靶點抑制作用研究

李靜 沈益民 林圣云 陳珍珍

●論 著

BIIB021對MDS細胞株Skm-1增殖的多靶點抑制作用研究

李靜 沈益民 林圣云 陳珍珍

目的 探討熱休克蛋白90（HSP-90）抑制劑BIIB021對骨髓增生異常綜合征（MDS）細胞株Skm-1增殖的多靶點抑制作用。方法 分別將0、100、200、400nmol/L BIIB021作用于4組Skm-1細胞（對照組、100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組），培養24h后采用Western blot法檢測各組細胞雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR復合物1（mTORC1）、低氧誘導因子-1α（HIF-1α)蛋白表達水平。 結果 各組Skm-1細胞mTOR蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。各組Skm-1細胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），即100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組Skm-1細胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平均低于對照組，且400 nmol/L組表達水平最低。 結論 BIIB021通過抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表達抑制Skm-1細胞增殖。

HSP-90 骨髓增生異常綜合征 mTORC1 HIF-1α

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組異質性、克隆性造血干細胞疾病，其主要特征是骨髓中原始細胞增多伴一系或多系發育異常（病態造血），并具有向急性白血病轉化的高風險。由于MDS的異質性，臨床對部分非典型MDS患者的診斷及預后評估存在困難；且MDS化療療效不佳，目前普遍認為其是不可治愈的。近年來，化療藥物地西他濱的應用及骨髓移植治療的開展雖挽救了小部分MDS患者的生命，但醫療費用昂貴、不良反應大、有效率低，大部分患者病情惡化死亡。因此，臨床迫切需要高效的藥物應用于MDS的治療。筆者團隊前期研究發現，熱休克蛋白90（HSP-90）抑制劑BIIB021能顯著抑制MDS細胞株Skm-1細胞增殖，并引起細胞凋亡[1]。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR復合物1（mTORC1）、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）是HSP-90介導的信號通路靶點蛋白。基于此，本研究將不同濃度BIIB021作用于 Skm-1細胞，采用 Western blot法檢測 mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平，旨在探討BIIB021對Skm-1細胞增殖的多靶點抑制作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MDS細胞株Skm-1由浙江大學醫學院附屬第一醫院惠贈；BIIB021購自美國Selleck Chemicals公司，用二甲基亞砜（DMSO，美國Cell-Signaling Technology公司）溶解為濃度1mmol/L，－20℃保存；胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司，mTORC1、HIF-1α抗體購自美國Cell-Signaling Technology公司，BCA蛋白定量試劑盒購自以色列Biological Industries公司。

1.2 細胞培養 將Skm-1細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度中培養。

1.3 Western blot法檢測mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平 取對數生長期Skm-1細胞，分別懸浮于10%FBS的RPMI 1640培養液中，按1×105個/ml的密度接種于培養瓶，使每瓶終體積為10ml。加入不同體積的BIIB021使4組藥物濃度分別為0、100、200、400nmol/L（對照組、100nmol/L組、200nmol/L組、400nmol/L組），37℃、5%二氧化碳培養箱中培養24h。1 000r/min離心5min收集各組細胞，加入裂解液冰上放置30min，超聲波細胞粉碎機處理后（160W，持續5s，間隔5s，工作5次），4℃，12 000r/min離心15min，收集細胞及其上清液于1.5ml離心管中，BCA法測定蛋白濃度，取45μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，開始電壓為60V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓增至120V。電泳結束后，400mA恒流濕轉100min將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗4℃搖床過夜，用1×TBST洗去非特異性結合的蛋白，加入二抗，室溫溫育2h，再用1×TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化學發光底物顯色，X線曝光后顯影定影。每個蛋白檢測重復3次，以β-actin為內參，用ImageJ軟件測量蛋白條帶灰度值，取平均值。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采取LSD-t檢驗。

2 結果

各組Skm-1細胞mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平比較見圖1、表1。

圖1 各組S k m-1細胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表達電泳圖

由圖1、表1可見，各組Skm-1細胞mTOR蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。各組Skm-1細胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；組間兩兩比較差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），即100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組Skm-1細胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平均低于對照組，且400 nmol/L組表達水平最低。

表1 各組S k m-1細胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表達水平比較（灰度值）

3 討論

HSP-90是很有前景的腫瘤治療靶點[2]。既往研究發現，HSP-90在MDS患者中高表達會影響疾病預后，并會使轉化為白血病的風險增高[3]。BIIB021是第一代人工合成的HSP-90抑制劑，有研究報道稱HSP-90抑制劑BIIB021對實體腫瘤和某些惡性血液系統疾病有較明顯的抑制作用，并已進入臨床研究階段[4]。筆者團隊前期實驗研究發現不同濃度（100、200、400nmol/L）BIIB021作用于Skm-1細胞后能夠明顯抑制細胞增殖，24、48h的細胞半抑制濃度分別為355.69、168.6 nmol/ L，并通過磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核因子κB（NF-κB）作用促進Skm-1細胞凋亡。本研究是在前期實驗的基礎上，通過Western blot法檢測BIIB021作用于Skm-1細胞后的mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達水平；結果顯示不同濃度（100、200、400 nmol/L）BIIB021作用于Skm-1細胞后均能明顯下調HIF-1α、mTORC1蛋白的表達水平，而對mTOR蛋白表達水平無明顯影響。

HIF-1由HIF-1α和HIFβ兩個亞單位組成，研究表明以HIF-1α升高為表現的骨髓微環境異常跟MDS疾病進展及轉化有關[5]。mTOR在生物體內以兩種復合物的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1既能被蛋白激酶B（Akt）激活，也能通過下游產物S6K1對Akt進行負反饋調節，PI3K/AKT/mTOR信號通路可調節細胞增殖、分化、存活和遷移等功能；這條通路的活性異常不僅能導致細胞惡性轉化，還與腫瘤細胞的侵襲轉移行為相關[6]；此外這條通路還可通過抑制HIF-1α蛋白的合成、減少HIF-1α蛋白的轉錄和核轉錄以及增加HIF-1 mRNA的降解來達到抑制腫瘤生長的作用[7-8]。

綜上所述，BIIB021通過抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表達抑制Skm-1細胞增殖，其具體的作用機制有待于臨床進一步深入研究。

[1]Lin S,Li J,Zhou W,et al.BIIB021,an Hsp90 inhibitor,effectively kills a myelodysplastic syndrome cell line via the activation of caspases and inhibition of PI3K/Akt and NF-κB pathway proteins[J].Exp Ther Med,2014,7(6):1539-1544.

[2]Isaacs J S,Xu W,Neckers L.Heat shock protein 90 as a molecular target for cancer therapeutics[J].Cancer Cell,2003,3(3): 213-217.

[3]Flandrin P,Guyotat D,Duval A,et al.Significance of heat-shock protein(HSP)90 expression in acute myeloid leukemia cells[J]. CellStress Chaperones,2008,13(3):357-364.

[4]Flandrin-Gresta P,Solly F,Aanei C M,et al.Heat Shock Protein 90 is overexpressed in high-risk myelodysplastic syndromes and associated with higher expression and activation of Focal Adhesion Kinase[J].Oncotarget,2012,3(10):1158-1168.

[5]Didelot C,Lanneau D,Brunet M,et al.Anti-cancer therapeutic approaches based on intracellular and extracellular heat shock proteins[J].Current Medicinal Chemistry,2007,14(27):2839-2847.

[6]Laplante M,Sabatini D M.mTOR signaling in growth control and disease[J].Cell,2012,149(2):274-293.

[7]Karar J,Cerniglia G J,Lindsten T,et al.Dual PI3K/Mtor inhibitor NVP-BEZ235 suppresses hypoxia-inducible factor(HIF)-1αexpression by blocking protein translation and increases cell death under hypoxia[J].Cancer BiolTher,2012,13(11):1102-1111.

[8]Jeong W,Rapisarda A,Park S R,et al.Pilot trial of EZN-2968,an antisense oligonucleotide inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 alpha(HIF-1α),in patients with refractory solid tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,73(2):343-348.

BIIB021 inhibits proliferation of myelodysplastic syndrome Skm-1 cells and its mechanism

LI Jing,SHEN Yimin,LIN Shengyue,

et al.Department of Emergency，Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Objective To investigate the effect of HSP-90 inhibitor BIIB021 on the proliferation of myelodysplastic syndrome(MDS)Skm-1 cells and related mechanisms.Methods Skm-1 cells were treated with 100,200 and 400nmol/l BIIB021 for 24h.The expression of proteins mTOR,mTORC1,HIF-1α in Skm-1 cells was examined by Western blot. Results The expression of protein mTOR in Skm-1 cells was not significantly changed after treatment with different concentrations of BIIB021 (P＞0.05).Compared to control group,the expression of mTORC1 and HIF-1α in Skm-1 cells treated with different concentrations of BIIB021 was significantly decreased(P＜0.05),and the expression was the lowest in the group of 400 nmol/L. Conclusion BIIB021 inhibits proliferation of MDS Skm-1 cells through down-regulating the expression of mTORC1 and HIF-1α.

HSP-90 MDS mTORC1 HIF-1α

2 0 1 6-0 7-0 3）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1016

3 1 0 0 1 3杭州，浙江醫院急診科

李靜，E-m a i l：l i j i n g 1 1 8 8 3 0@1 2 6.c o m