Tfh細胞相關因子CXCL-13在小細胞肺癌中的作用及臨床意義

趙靜 游雅婷 錢頻 范曄

?

·論著·

Tfh細胞相關因子CXCL-13在小細胞肺癌中的作用及臨床意義

趙靜1游雅婷1錢頻2范曄1

目的探討Tfh細胞的趨化因子CXCL-13與SCLC發(fā)病及進展的相關性。方法隨機收集28例SCLC患者(SCLC組)和38例健康人(對照組)的臨床資料和外周血樣本，采用ELISA法檢測小細胞肺癌(SCLC)患者外周血中濾泡性輔助性T細胞(follicular helper T cells, Tfh)的趨化因子CXC基元配體-13(chemokine C-X-C motif ligand-13, CXCL-13)表達水平，結合臨床資料按照性別、年齡、吸煙情況及腫瘤分期進行亞組分析，明確各相關因素與SCLC的關系。結果SCLC組CXCL-13(55.36±5.293)ng/L明顯高于對照組(28.71±2.671)ng/L，P<0.0001；在SCLC組中年齡、性別及吸煙史差異對CXCL-13表達沒有顯著差異：男性(53.52±5.759) ng/L、女(64.59±14.08) ng/L，P=0.4995；年齡<55歲(50.08±6.945)ng/L、年齡≥55歲(58.01±7.184) ng/L,P=0.4347; 吸煙<200年支(62.59±8.975) ng/L、吸煙≥200年支(68.09±4.128) ng/L，P=0.5854。而在SCLC組與對照組的對比中，各因素對CXCL-13的表達均有一定的影響，女性(9.976±1.534 ng/L，64.59±14.08 ng/L，P=0.0028)，男性(31.07±3.778 ng/L，53.52±5.759 ng/L，P=0.0023)；年齡<55歲(27.77±2.987 ng/L，50.08±6.945 ng/L，P=0.0121)，年齡≥55歲(31.75±6.096 ng/L，58.01±7.184 ng/L，P=0.01)；吸煙<200年支(28.15±2.723 ng/L，62.59±8.975 ng/L，P=0.0028)；吸煙≥200年支(28.86±7.312 ng/L，68.09±4.128 ng/L，P=0.0005)。SCLC組中，不同腫瘤分期的CXCL-13表達有顯著差異，(31.07±2.37 ng/L，57.18±5.919 ng/L，P=0.0003)。結論在SCLC患者的外周靜脈血中CXCL-13的表達水平與健康對照組有顯著差異，且與性別、年齡、吸煙情況有密切關系，同時腫瘤分期越晚的患者，其CXCL-13的表達水平越高。CXCL-13作為Tfh的趨化因子，對SCLC的早期臨床診斷和預后判斷有潛在的臨床意義。

小細胞肺癌； CXCL-13； Tfh； 臨床意義

肺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，發(fā)病率為腫瘤的首位。每年有數百萬的人死于肺癌[1-3]。組織病理學分型分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[4]。SCLC是其中惡性程度最高的一種，且由于早期診斷困難致使患者的療效不佳，預后較差。目前隨著診斷方法進步、規(guī)范有序的診斷、分期、新化療藥物以及靶向治療藥物的出現，以及以肺癌生物學行為為依據的多學科聯(lián)合治療的不斷進步，SCLC患者的生存率有所提高。然而，想要進一步提高該患者群的生存率，仍有賴于早期診斷和規(guī)范治療[5-6]。目前，肺癌病因和發(fā)病機制尚未明確，對于發(fā)病機制及其相關影響因素的研究探索，是引領肺癌治療突破的重要方向。近年來，腫瘤間質中浸潤的炎性細胞及其趨化因子在肺癌發(fā)生和進展中的地位愈加得到肯定。濾泡性輔助性T細胞(follicular helper T cells, Tfh)是近期發(fā)現的一種特殊的輔助性T淋巴細胞[7]，定位于淋巴濾泡，屬于CD4+T細胞亞群[8-9]，表達 趨化因子CXC基元配體-13(chemokine C-X-C motif ligand-13, CXCL-13)、白細胞介素-21(interleukin-21, IL-21)、 程序性細胞死亡-1(programmed cell death-1, PD-1)、B細胞淋巴瘤-6(B cell lymphoma-6, Bcl-6)等表面分子，它們對Tfh細胞的遷移、定位、分化、發(fā)育等起重要的輔助作用[10-13]。研究表明，Tfh細胞與多種疾病的發(fā)生有關，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染性疾病和腫瘤(包括NSCLC)等[9, 14-17]。然而Tfh細胞及其相關細胞因子與SCLC的相關性目前未見明確的報道。對Tfh相關細胞因子與SCLC的相關性的臨床探索，可以促進我們對SCLC的發(fā)生、發(fā)展機制的新理解，并可能為SCLC的早期診斷與創(chuàng)新治療的新靶位點提供新思路[18-20]。本研究以SCLC患者及健康人作為研究對象，通過檢測和對比患患者群及健康對照組外周血中CXCL-13的表達水平[21-22]，并結合臨床資料探討Tfh細胞趨化因子CXCL-13與SCLC發(fā)生發(fā)展的關系。

材料與方法

一、臨床資料

隨機選取第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸內科住院患者，并經病理學證實的SCLC患者28例作為SCLC組。其中男性23例，女性5例；年齡小于55周歲10例，年齡大于或等于55周歲18例；吸煙數小于200年支13例，大于200年支15例；有轉移情況23例，無轉移情況5例；腫瘤Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期4例，Ⅳ期20例。隨機選取第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院體檢中心體檢健康人38例，作為對照組，其中男性20例，女性18例，年齡小于55周歲29例，年齡大于或等于55周歲9例，吸煙數小于200年支30例，大于200年支8例。兩組性別、年齡、吸煙史比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，所有研究對象均被告知研究內容，并簽署知情同意書。

二、研究方法

所有研究對象均為早上空腹(住院患者為入院當日治療前)，用紅頭管(含促凝劑)抽取肘部靜脈血約4 ml，室溫靜置自凝30 min后，以離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心 10 min，取上清后于-80攝氏度冰箱保存，檢測前所有標本于4度冰箱融化后再放置室溫完全溶解，檢測CXCL-13表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各組患者外周血中CXCL-13的表達水平，試劑盒由R&D公司生產，并按試劑盒操作說明書進行操作。

三、統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學處理采用SSPS20.0統(tǒng)計軟件包，通過t檢驗、列聯(lián)表ANOVA、方差分析等比較各組差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組外周血中CXCL-13水平比較

SCLC患者組血清的CXCL-13水平較健康對照組有明顯增高(55.36±5.293 ng/L，28.71±2.671 ng/L)，P<0.0001(圖1A)。同時發(fā)現，將總體人群分別按照性別、年齡以及吸煙情況各亞組比較，CXCL-13的水平沒有統(tǒng)計學意義，數據分別是性別亞組(43.27±3.910 ng/L，34.24±5.189 ng/L)，年齡亞組(49.86±5.720 ng/L，37.62±3.198 ng/L)，吸煙情況亞組(53.18±1.318 ng/L，43.1±3.761 ng/L)，見圖1B、C、D。

圖1 SCLC組和健康對照組的CXCL-13的表達水平的比較

二、兩組各亞組CXCL-13表達水平的比較

按年齡、性別及吸煙情況3個亞組比較了CXCL-13在SCLC組與對照組之間表達水平的差異，顯示不同性別、年齡及吸煙情況的SCLC患者的外周血CXCL-13水平與相應對照組相比，均存在顯著的統(tǒng)計學差異，見圖2A、B、C、D、E、F。

三、SCLC組中CXCL-13與腫瘤臨床分期的相關性

為進一步探索Tfh的特異性趨化因子CXCL-13與SCLC臨床分期之間的關聯(lián)，本實驗按照患者的TNM臨床分期進行分析，分別檢測和統(tǒng)計各組SCLC患者中外周血的CXCL-13表達水平。CXCL-13的表達水平與單一臨床腫瘤分期之間不存在顯著的統(tǒng)計學差異(圖3A，表1)。然而，將Ⅰ期和Ⅱ期合并，Ⅲ期和Ⅳ期合并之后，再次分析發(fā)現，CXCL-13的血清學表達水平與臨床分期有著顯著的統(tǒng)計學差異(31.07±2.37 ng/L，57.18±5.919 ng/L，P=0.0003)(圖3B)。

圖3 CXCL-13的表達與肺癌分期的關系

表1 不同腫瘤分期病人兩兩檢驗P值表

圖2 SCLC組與健康對照組各亞組CXCL-13表達水平的比較

四、SCLC組中各亞組血清CXCL-13表達水平的比較

分別按照性別、年齡以及吸煙情況3個亞組進一步分析血清CXCL-13表達的情況，發(fā)現在SCLC組各亞組中，各亞組血清中CXCL-13表達水平無顯著差異(P>0.05)。分別為A性別：(53.52±5.759 ng/L，64.59±14.08 ng/L)，B年齡：(50.08±6.945 ng/L，58.01±7.184 ng/L)，C吸煙情況：(62.59±8.975 ng/L，68.09±4.128 ng/L)，見圖4A、B。

圖4 SCLC患者中各亞組CXCL-13的表達

討 論

肺癌是當今世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，它嚴重威脅著人類的健康和生命[23-25]。在世界上許多國家，肺癌的發(fā)病率都出現了明顯增高的趨勢[26-28]。而在中國的很多城市，肺癌患者的數量在各種惡性腫瘤患者中更是達到了第一位。有研究統(tǒng)計，到2025年，我國每年因為肺癌而死亡的人數將達到約90萬人。現在，肺癌已經不像過去那樣被人們認為是一種少見的疾病了，肺癌與艾滋病已被世界衛(wèi)生組織報告為是21世紀對人類健康威脅最大的兩種常見的疾病。因此，對肺癌的發(fā)病機制、發(fā)生發(fā)展影響因素以及診療措施的研究刻不容緩，這也成為當今醫(yī)學發(fā)展進程中一個熱門命題。肺癌按照病理組織分型可以分為SCLC和NSCLC。目前，對于NSCLC的發(fā)病機制以及診療方法的研究已經較為豐富。而對于SCLC，它是一種高度惡性的腫瘤，臨床病情進展明顯快于NSCLC，其發(fā)病率占所有肺癌的10%～25%，占肺神經內分泌腫瘤的80%～90%。SCLC病情發(fā)展迅速，惡性程度高，預后較差，雖然其對放化療敏感，手術聯(lián)合放化療等綜合治療極大提高了早期SCLC患者的生存時間，但由于目前對SCLC的發(fā)病機制不是十分清楚，其早期診斷和規(guī)范治療仍受到了極大的限制。所以，進一步探究SCLC的發(fā)病機制將有助于該疾病的早期診治，對提高SCLC患者的生存率也有著極其重要的臨床意義。CXCL-13、IL-2、PD-1、Bcl-6等表面分子，對Tfh細胞的遷移、定位、分化、發(fā)育等起重要的輔助作用。研究表明，循環(huán)Tfh細胞在人類自身免疫性疾病和癌癥中可作為診斷和判斷預后的生物學標志物。本實驗主要研究的是Tfh細胞趨化因子CXCL-13在SCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床意義。

本研究發(fā)現：(1)CXCL-13在SCLC組中的表達水平明顯高于健康對照組。在以總人群為研究對象時，我們將其分為3組，即男性與女性相對照、年齡小于50歲與大于等于50歲相對照、吸煙小于200年支與大于等于200年支相對照，發(fā)現CXCL-13的表達水平均無顯著統(tǒng)計學差異。并可以排除實驗過程中因為年齡、性別以及吸煙程度對本實驗發(fā)現的影響，從而可以得出：在SCLC患者中，CXCL-13作為Tfh細胞標志性的趨化因子，其表達水平明顯高于健康人群；(2)分別將SCLC組和健康對照組按照年齡、性別、吸煙情況進行分組分析，分別比較CXCL-13的表達水平，發(fā)現各亞組中，CXCL-13的表達水平均有顯著的統(tǒng)計學差異，SCLC組CXCL-13表達水平明顯高于健康組。這進一步排除了年齡、性別以及吸煙情況對本實驗結果的影響，更有力地證明了(1)中的結論；(3)同時，檢測了不同TMN分期的SCLC患者外周血的CXCL-13表達水平，發(fā)現不同TMN腫瘤分期的SCLC患者的CXCL-13表達水平存在顯著統(tǒng)計學差異，進一步分析發(fā)現，分期越晚的SCLC患者外周血中CXCL-13表達水平越高。由此推測，CXCL-13與SCLC的發(fā)生有著明顯的相關性；(4)最后，將實驗中的所有SCLC患者按照年齡、性別、吸煙情況進行分組，分別分析CXCL-13在各組的表達水平。發(fā)現不同年齡、不同性別以及不同吸煙情況的SCLC患者的CXCL-13表達水平沒有顯著性統(tǒng)計學差異。

綜上所述， Tfh細胞趨化因子CXCL-13在SCLC患者的表達水平是呈顯著增高的，且增高水平與肺癌分期相關，分期越高，其表達水平越高。這提示Tfh細胞趨化因子CXCL-13與SCLC的惡性程度有確切的相關性，并且可能在SCLC的發(fā)生發(fā)展中起一定的促進作用。根據實驗結論，或許將來可以通過檢測患者外周血中的CXCL-13來幫助早期發(fā)現及診斷SCLC，同時也可以根據CXCL-13的表達水平，結合影像學資料以及其他輔助檢查對SCLC患者進行預后的初步判斷。本實驗結果為下一步明確CXCL-13在SCLC中的具體作用機制奠定了必要的基礎條件。同時，研究還提示，Tfh細胞在SCLC的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要作用。除了CXCL-13以外，Tfh其他相關分子也可能扮演著十分重要的角色，然而其具體功能和相關機制尚有待進一步深入研究。

1 任成山, 白莉, 錢桂生. 慢性阻塞性肺疾病合并肺癌臨床特征及新理念[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2015, 8(2): 137-142.

2 王會中, 任成山, 金發(fā)光. 腫瘤生物標志物在肺癌患者檢測中的臨床意義及研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2016, 9(3): 329-333.

3 Lawrence RE, Salgia R, MET molecular mechanisms and therapies in lung cancer[J]. Cell Adh Migr, 2010, 4(1): 146-152.

4 Liang Y, Tian B, Zhang J, et al. Tumor-targeted polymeric nanostructured lipid carriers with precise ratiometric control over dual-drug loading for combination therapy in non-small-cell lung cancer[J]. Int J Nanomedicine, 2017, 12: 1699-1715.

5 Hamilton G, Rath B, Ulsperger E. How to target small cell lung cancer[J]. Oncoscience, 2015, 2(8): 684-692.

6 Zhou T, Hong S, Hu Z, et al. A systemic inflammation-based prognostic scores (mGPS) predicts overall survival of patients with small-cell lung cancer[J]. Tumour Biol, 2015, 36(1): 337-343.

7 Saavedra D, Garcia B, Lage A. T cell subpopulations in healthy elderly and lung cancer patients: Insights from cuban studies[J]. Front Immunol, 2017, 8: 146.

8 Johnston RJ, Poholek AC, DiToro D, et al. Bcl6 and blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation[J]. Science, 2009, 325(5943): 1006-1010.

9 Ma CS, Suryani S, Avery DT, et al. Early commitment of naive human CD4(+) T cells to the T follicular helper (T(FH)) cell lineage is induced by IL-12[J]. Immunol Cell Biol, 2009, 87(8): 590-600.

10 Akiba H, Takeda K, Kojima Y, et al. The role of ICOS in the CXCR5+ follicular B helper T cell maintenance in vivo[J]. J Immunol, 2005, 175(4): 2340-2348.

11 Rasheed AU, Rahn HP, Sallusto F, et al. Follicular B helper T cell activity is confined to CXCR5(hi)ICOS(hi) CD4 T cells and is independent of CD57 expression[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(7): 1892-1903.

12 Bauquet AT, Jin H, Paterson AM, et al. The costimulatory molecule ICOS regulates the expression of c-Maf and IL-21 in the development of follicular T helper cells and TH-17 cells[J]. Nat Immunol, 2009, 10(2): 167-175.

13 Pangault C, Amé-Thomas P, Ruminy P, et al. Follicular lymphoma cell niche: identification of a preeminent IL-4-dependent T(FH)-B cell axis[J]. Leukemia, 2010, 24(12): 2080-2089.

14 Ito T, Hanabuchi S, Wang YH, et al. Two functional subsets of FOXP3+ regulatory T cells in human thymus and periphery[J]. Immunity, 2008, 28(6): 870-880.

15 Shi W, Li X, Cha Z, et al. Dysregulation of circulating follicular helper T cells in nonsmall cell lung cancer[J]. DNA Cell Biol, 2014, 33(6): 355-360.

16 Zhou DM, Xu YX, Zhang LY, et al. The role of follicular T helper cells in patients with malignant lymphoid disease[J]. Hematology, 2017, doi: 10.1080/10245332.2017.1300623.

17 Ma QY, Huang DY, Zhang HJ, et al. Function of follicular helper T cell is impaired and correlates with survival time in non-small cell lung cancer[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 41: 1-7.

18 Hamilton G, Rath B, Smoking. inflammation and small cell lung cancer: recent developments[J]. Wien Med Wochenschr, 2015, 165(19-20): 379-386.

19 Sheng SY, Gu Y, Lu CG, et al. The distribution and function of human memory T cell subsets in lung cancer[J]. Immunol Res, 2017, doi: 10.1007/s12026-016-8882-y.

20 Jiang W, Zhang W, Wu L, et al. MicroRNA-related polymorphisms in PI3K/Akt/mTOR pathway genes are predictive of limited-disease small cell lung cancer treatment outcomes[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 6501385.

21 Chen L, Huang Z, Yao G, et al. Erratum to: The expression of CXCL13 and its relation to unfavorable clinical characteristics in young breast cancer[J]. J Transl Med, 2016, 14(1): 318.

22 Hui W, Zhao C, Bourgoin SG. LPA Promotes T cell recruitment through synthesis of CXCL13[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: 248492.

23 Yuan F, Si-Ning C, Ji-Hong Z, et al. Clinical study of lung-supplementing and stasis-dissolving decoction (Bufei Huayu Tang) combined with gefitnib for treatment of advanced non-small cell lung cancer[J]. Pak J Pharm Sci, 2016, 29(6(Special)): 2185-2189.

24 Morrison EJ, Novotny PJ, Sloan JA, et al. Emotional problems, quality of life, and symptom burden in patients with lung cancer[J]. Clin Lung Cancer, 2017, doi: 10.1016/j.cllc.2017.02.008.

25 Ferguson MK, Huisingh-Scheetz M, Thompson K, et al. The influence of physician and patient gender on risk assessment for lung cancer resection[J]. Ann Thorac Surg, 2017, doi: 10.1016/j.athoracsur.2017.01.066.

26 Zhou D, Tang W, Liu X, et al. Clinical verification of plasma messenger RNA as novel noninvasive biomarker identified through bioinformatics analysis for lung cancer[J]. Oncotarget, 2017 ,doi: 10.18632/oncotarget.16701.

27 Zhao F, Zhou Y, Ge PF, et al. A prediction model for lymph node metastases using pathologic features in patients intraoperatively diagnosed as stage I non-small cell lung cancer[J]. BMC Cancer, 2017, 17(1): 267.

28 Sateia HF, Choi Y, Stewart RW, et al. Screening for lung cancer[J]. Semin Oncol, 2017, 44(1): 74-82.

(本文編輯：黃紅稷)

趙靜，游雅婷，錢頻，等. Tfh細胞相關因子CXCL-13在小細胞肺癌中的作用及臨床意義[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 178-182.

Role and clinical significance of Tfh cell associated factor CXCL-13 in the pathogenesis of small cell lung cancer

ZhaoJing1,YouYating1,QianPin2,FanYe1.

1DepartmentofRespiratoryDiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400037,China;2InstituteofRespiratoryDiseasesofPLA,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, 400037,China

FanYe,Email:fygan2007@163.com

Objective To detect expression levels of follicular helper T cells (follicular helper T cells, Tfh) chemokine C-X-C motif ligand-13 (CXCL-13) in small cell lung cancer (SCLC) patients and healthy human peripheral blood, to investigate the interaction between Tfh cells chemokine CXCL-13 and SCLC in the pathogenesis and progression. Methods It was randomly collected that the clinical data and peripheral blood samples of 28 cases of SCLC patients (SCLC group) and 38 healthy people (control group), Tfh cell chemokine CXCL-13 was detected by ELISA assay in peripheral blood, combined with clinical data, according to gender, age, smoking status and tumor stage subgroup analysis, clear the relationship between the related factors and SCLC. Results SCLC group CXCL-13 (55.36±5.293) ng/L was significantly higher than the control group (28.71±2.671 ng/L),P<0.0001; in the SCLC group, age, sex and smoking history differences on the expression of CXCL-13 had no significant difference: male(53.52 ± 5.759) ng/L, female (64.59 ± 14.08) ng/L,P=0.4995; aged <55 years old (50.08±6.945)ng/L, aged≥55 years old (58.01±7.184)ng/L,P=0.4347; smoking<200 years (62.59±8.975)ng/L, smoking≥200 years (68.09±4.128)ng/L,P=0.5854. And in contrast to the SCLC group and the control group, the influencing factors on CXCL-13 expression were female (9.976±1.534, 64.59±14.08 ng/L,P=0.0028), male (31.07±3.778 ng/L, 53.52±5.759 ng/L,P=0.0023); age<55 (27.77±2.987 ng/L, 50.08±6.945 ng/L,P=0.0121), aged≥55 years old (31.75±6.096 ng/L, 58.01±7.184 ng/L,P=0.01); smoking<200 years (28.15±2.723 ng/L, 62.59±8.975 ng/L,P=0.0028); smoking≥200 years (28.86±7.312 ng/L, 68.09±4.128 ng/L,P=0.0005). In the SCLC group, the expression of CXCL-13 in different tumor stage had significant difference(31.07±2.37 ng/L, 57.18±5.919 ng/L,P=0.0003). Conclusions The expression level of CXCL-13 in patients with SCLC in peripheral blood were significantly different from those of the healthy control group, and gender, age, smoking status are closely related, and the later stage of tumor patients, the CXCL-13 expression level is higher. CXCL-13, as a chemokine of Tfh, has potential clinical significance in early diagnosis and prognosis of SCLC.

Small cell lung cancer; CXCL-13; Tfh; Clinical significance

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.013

國家自然科學基金資助項目(81570051)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院呼吸內科1400037 重慶，第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院野戰(zhàn)內科研究所2

范曄， Email: fygan2007@163.com

R734.2，R563

A

2017-03-10)