基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因

劉俊彥 呂學軍 趙維 胡明冬 李玉英 王關嵩 徐劍誠 錢桂生

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·論著·

基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因

劉俊彥 呂學軍 趙維 胡明冬 李玉英 王關嵩 徐劍誠 錢桂生

目的篩選小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因，探討Sirt1在急性呼吸窘迫綜合征炎癥反應中的作用機制。方法購買Sirt1過表達(Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠，飼養、繁殖、鑒定新生小鼠基因型；Western Blot鑒定小鼠肺組織Sirt1表達差異；建立ARDS小鼠模型，觀察ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化，并采用ELISA檢測兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達差異；采用基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS炎癥損傷中相互作用的基因。結果通過聚合酶鏈反應鑒定出Tg和WT兩種不同基因型的小鼠；免疫印跡法檢測小鼠肺組織Sirt1的表達差異結果提示Tg小鼠肺組織Sirt1含量顯著高于WT小鼠(P=0.001)；不同濃度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺組織HE染色病理變化提示隨著LPS用量增加，兩種小鼠肺組織損傷程度明顯增加，且WT-ARDS小鼠的肺組織損傷程度比Tg-ARDS小鼠更為嚴重；當LPS用量達到20 mg/kg時兩組小鼠存活率<50%；兩種小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)后，肺組織IL-6的表達隨時間推移逐漸呈現逐漸增高的趨勢，在3，6，12，24 h WT-ARDS組肺組織IL-6表達濃度顯著高于Tg-ARDS組(P<0.05)，尤其在12 h差異最為顯著(P=0.007)。基因芯片篩選出在小鼠ARDS炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因有Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1。結論Sirt1可能通過調控Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1的表達減輕ARDS小鼠的炎癥損傷。

急性呼吸窘迫綜合征； 沉默信息調節因子1； 泛素D； 核轉錄因子κB

Sirtuins是第三類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)，其分布廣泛，底物眾多，作用機制復雜。哺乳動物Sirt1(Sirtuin type 1)是酵母沉默信息調節因子2(Sir2)的同源基因，其功能的發揮依賴NAD+[1]。核定位的Sirt1因其能去乙酰化組蛋白，從而具有調控多種關鍵的生理和病理過程，以及多種疾病發生發展的能力。研究發現乙酰白藜蘆醇(AC-Res，Sirt1激活劑)預處理能使急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)小鼠的炎癥反應減輕[2]，因此有學者將Sirt1定義為ARDS炎癥反應的關鍵分子之一[3]，但Sirt1參與ARDS發生發展的機制目前仍未闡明，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有較全面的報道。本實驗通過對兩種不同Sirt1基因的ARDS小鼠肺組織基因芯片進行分析，篩選小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因。

材料和方法

一、研究材料

實驗動物 從美國Jackson實驗室購入Sirt1superB6.Cg-Tg(Sirt1)ASrn/J小鼠(簡稱Tg小鼠)雄鼠2只和野生型(WT)雌性小鼠2只。小鼠飼養在第三軍醫大學新橋醫院動物中心，按照雌雄1︰1繁殖，室內恒溫25 ℃，照明12 h晝夜交替，喂食飼料制備于第三軍醫大學動物中心，子代小鼠21 d斷乳分籠，待8周齡后繼續近親繁殖。

二、主要設備和試劑

SDS-PAGE電泳設備，PCR儀，水平電泳儀，Thermo紫外分光光度計，TIANGEN快速DNA提取擴增套裝，Trizol、RIPA強裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Trisbase、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、LPS均來自Biosharp公司，Anti-SIRT1抗體(Abcam公司)，Actin β Polyclonal Antibody(ruiying biological公司)，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(QuantiCyto)，Agilent mRNA 單通道表達譜芯片。

三、測定方法

1. 動物基因型鑒定

(1)小鼠基因組DNA提取對10～12 d 子代小鼠打耳標編號，并剪取0.5 cm尾巴進行鑒定。基因組DNA提取方法按照TIANGEN快速DNA提取擴增套裝，紫外分光光度計進行DNA定量。

(2)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)引物來自Jackson實驗室官網，Tg小鼠標記(350 bp)F：5′-AGA TAG TTC ACC GGG GTG AGA-3′；Tg-R：5′-TCG GTC GAA GAG TAT CTG GTG-3′。內參(200 bp)F：5′-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3′；內參R：5′-GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT-3′。反應體系25 μl。擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保溫。

2. Western blot鑒定小鼠Sirt1表達: 8～12周齡小鼠，無菌條件下取出肺組織，按照RIPA強裂解液提供方法抽提肺組織蛋白，BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。加入5*蛋白上樣緩沖液，沸水變性5 min。SDS-PAGE電泳和顯影：兔抗鼠Sirt1抗體(1︰500)或兔抗鼠β-actin抗體(1︰1 000)；山羊抗兔抗體(1︰1 000)。

3. ARDS小鼠模型的建立

(1) ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化差異：隨機選取Tg和WT小鼠(8～12 W)各20只，各隨機分為5組，分別腹腔注射LPS(0 mg/kg)，LPS(5 mg/kg)，LPS(10 mg/kg)，LPS(15 mg/kg)，LPS(20 mg/kg)[4]，自由進食水，12 h后無菌條件下取出肺組織，用4%多聚甲醛固定72 h，常規制備石蠟切片，帶HE染色。

(2) ELISA檢測兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達差異：隨機選取Tg和WT小鼠(8～12 W)各15只，腹腔注射LPS(15 mg/kg)，分別在0、3、6、12、24 h各處死小鼠3只，取肺組織100 μg，加入1 ml PBS，冰上勻漿10 s，4 ℃，以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心10 min取上清。按照QuantiCyto小鼠IL-6 ELISA試劑盒說明檢測不同時間點小鼠肺組織IL-6的表達水平。

4. 基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因[5]: 根據以上實驗結果，隨機選取Tg和WT小鼠(8～12 w)各10只，各隨機分為2組，實驗組腹腔注射LPS(15 mg/kg)對照組生理鹽水處理，自由進食水，12 h后無菌條件下取出肺組織，Trizol法提取肺組織mRNA，-80 ℃保存。Agilent mRNA 單通道表達譜芯片檢測，由北京博奧公司提供檢測服務。

三、統計學方法

結 果

一、基因型鑒定

經過繁殖、基因型鑒定篩選出Tg小鼠和WT小鼠，1，2，5，6表達350 bp條帶和200 bp條帶，為Tg小鼠；3，4，7，8只表達200 bp條帶，為WT小鼠，見圖1。

二、小鼠Sirt1表達檢測

免疫印跡法檢測兩種不同Sirt1基因背景的小鼠肺組織Sirt1的含量，Tg小鼠肺組織Sirt1表達水平顯著高于WT小鼠(P=0.001)，見圖2。

三、ARDS小鼠模型

1. ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化： ARDS小鼠肺組織HE染色觀察不同濃度LPS腹腔注射12小時后肺組織的病理形態，見圖3，當LPS用量從5 mg/kg經10 mg/kg增加到15 mg/kg時，兩種小鼠肺組織損傷程度明顯增加，鏡下表現為肺組織彌漫性出血、肺泡腔內紅細胞漏出、肺泡間隔破壞增寬、肺組織內中性粒細胞浸潤均不同程度增加，且Tg-ARDS小鼠的肺組織損傷程度比WT-ARDS小鼠輕；LPS(20 mg/kg)兩組小鼠存活率<50%，未做進一步分析。

2. ARDS小鼠肺組織IL-6表達: 小鼠LPS 15 mg/kg腹腔注射，分別在不同的時間點檢測小鼠肺組織IL-6的表達差異，見圖4，兩種ARDS小鼠肺組織IL-6的表達隨時間推移逐漸增加，與0 h對比均差異顯著(P<0.01)；兩種對照組小鼠(0 h)肺組織IL-6濃度差異無統計學意義(P=0.239)，在3、6、12、24 h WT-ARDS組肺組織IL-6濃度顯著高于Tg-ARDS組(P<0.05)，尤其在12 h最為顯著(P=0.007)。

圖1 小鼠基因鑒定

圖2 小鼠肺組織Sirt1表達

圖4 兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達變化

四、基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因

通過對基因芯片的數據聚類分析WT-ARDS：WT-Control表達差異顯著的炎癥相關基因有1 000余個，經與WT-ARDS： Tg-ARDS所得結果交叉對比

圖3 不同濃度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺組織以病理變化(HE×20)

和查閱文獻共得到6個在小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因，見表1。其中促炎基因4個，分別為Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述4個基因表達上調；抗炎基因2個，為Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述兩個基因表達下調，具體差異倍數見表1“FC (abs) WT-ARDS：Tg-ARDS”列。

表1 小鼠ARDS炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因

討 論

ARDS是由肺內外各種致病因素引起的，以頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征[5-6]。ARDS病因繁多，不同病因所致急性呼吸窘迫綜合征發病機制也各有不同，其中肺炎是引起直接肺損傷的最常見原因[7-8]，而不可控的肺內炎癥、內皮和上皮細胞損傷是ARDS 發生發展的重要部分[9]。細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是參與重癥肺炎患者進展為ARDS的重要分子，也是實驗中常用制備ARDS動物模型的試劑[10]。Sirt1廣泛分布于人體各種組織器官，參與炎癥、細胞凋亡/增殖、細胞分化/衰老、新陳代謝和細胞周期調控等多種生理病理過程[11]。組織病理學提示AC-Res處理顯著減少中性粒細胞從血管到肺泡的滲漏，而AC-Res除了調節炎性細胞因子的表達外，還影響參與炎癥發病機制的酶和介質的活化[12]。但Sirt1參與ARDS發生發展的機制目前仍待探索，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有較全面的報道。

本實驗所用Sirt1過表達轉基因小鼠來自Jackson實驗室[13]。實驗發現兩種小鼠在經不同劑量的LPS腹腔注射12 h后，Tg小鼠的肺組織損傷程度均較WT小鼠輕；且LPS 15 mg/kg腹腔注射12 h后，T g小鼠炎癥因子IL-6的表達水平也明顯低于WT小鼠。證明Sirt1能減輕ARDS小鼠的炎癥反應。通過對基因芯片的數據聚類分析和查閱文獻共得到6個在小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因。其中促炎基因4個，分別為Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上4個基因表達上調，即這些基因在WT-ARDS中的表達高于Tg-ARDS；其中抗炎基因2個，為Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上2個基因表達下調，即這些基因在WT-ARDS中的表達低于Tg-ARDS。泛素D(ubiquitin D, Ubd)、泛素偶聯酶E2D2B(ubiquitin-conjugating enzyme E2D2B, Ube2d2b)、嗅覺素-4(olfactomedin-4, Olfm4)、白細胞介素-1受體1(interleukin-1 receptor-like 1, Il1rl1)、轉錄因子HIVEP3(transcription factor HIVEP3)均與NF-κB通路密切相關：Ubd通過促進蛋白酶體降解泛素化的IκBα，參與調控LPS介導的NF-κB的活化[14-15]；Ube2d2b參與NFκBIα的降解；Olfm4通過NOD1和NOD2介導的NF-κB激活和隨后的細胞因子和趨化因子產生在幽門螺桿菌感染的宿主防御中發揮重要作用[16]；NF-κB參與調節粒細胞集落刺激因子引起的Olfm4的表達，在早期骨髓發育中起重要作用[17]。Il1rl1是IL-33的受體，IL-33是一種促炎癥因子，可以通過細胞膜表面的ST2及相關信號傳導蛋白Acp受體復合物，將活化信號傳遞到胞內，經過一系列的信號傳遞，激活NF-κB[18]和MAPK等，誘導效應因子IL-5等的釋放，起到調節免疫應答等的功能；此外IL-33能激活巨噬細胞，增加氣道炎癥反應[19]。HIVEP3抑制TNF-α誘導的NF-κB激活作用顯著，能通過多種機制干預NF-κB[20-21]：作為一種轉錄因子，通過抑制 KκB基團抑制核轉錄；通過非轉錄途徑-通過與TRAF2(一種腫瘤壞死因子信號轉導中的適配分子)協作抑制RELA的核異位，阻斷IKK復合體的形成。溶血磷脂酸受體1(lysophosphatidic acid receptor 1, Lpar1)是溶血磷脂酸 (LPA)的受體，LPA通過誘導趨化因子和脂質介質的釋放在肺炎癥中起重要作用。研究發現LPA能誘導肺上皮細胞中白細胞介素-8和前列腺素E2的分泌；LPA1的敲除或活性抑制對LPS誘導的肺部炎癥有著顯著的保護作用[22]。因此，Sirt1可能是通過下調ARDS小鼠炎癥損傷中促炎基因Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1的表達和上調抗炎基因Hivep3和Lpar1的表達發揮炎癥調節作用，從而減輕ARDS小鼠的炎癥損傷。

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(本文編輯：王亞南)

劉俊彥，呂學軍，趙維，等. 基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 168-172.

Screening of genes interacting with Sirt1 in inflammatory injury of acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip

LiuJunyan,LyuXuejun,ZhaoWei,HuMingdong,LiYuying,WangGuansong,XuJiancheng,QianGuisheng.

Departmentofrespiratorymedicine,XinQiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

LiYuying,Email:lzhlyyhy@163.com

Objective To Screen of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip, and to provide a reference for exploring the mechanism of action of Sirt1 in acute respiratory distress syndrome. Methods Sirt1 overexpression (Tg) mice and wild type (WT) mice were bought for research, and the genotypes of newborn mice were identified after reproduction. The Sirt1 expression differences in lung tissue of Tg mice and WT mice were test by Western Blot. Construction of ARDS mouse model, the expression of IL-6 in lung tissue of two ARDS mice was detected by ELISA, and pathological changes in lung tissue of ARDS mice by HE staining were observed. Screening of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip. Results Two different genotypes of Tg and WT were identified by polymerase chain reaction (PCR). The expression of Sirt1 in lung tissue of mice which detecting by Western blot suggested that the Sirt1 in lung tissue of Tg mice was significantly higher than that of WT mice (P=0.001). Pathological changes of lung tissue of mice after intraperitoneal injection of LPS after LPS via HE staining prompted that with the increase of LPS dosage, the injury degree of lung tissue of two kinds of mice increased obviously, and the degree of lung injury in WT-ARDS mice was more serious than that of Tg-ARDS mice,and when the dosage of LPS reached 20 mg/kg, the survival rate of the two groups was <50%. Two kind of mice were injected intraperitoneally with LPS (15 mg/kg), The expression of IL-6 in lung tissue gradually increased with the passage of time,The expression of IL-6 in lung tissue of 3 h, 6 h,12 h, 24 h inWT-ARDS group was significantly higher than that in Tg-ARDS group(P<0.05), morever, the difference was the most significant especially in 12 h(P=0.007).Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1 were identified as genes that interact with Sirt1 in mouse ARDS inflammatory lesions by gene chip screening. Conclusion Sirt1 may reduce the inflammatory damage in ARDS mice by regulating the expression of Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1.

Acute respiratory distress syndrome; Sirtuin type 1; Ubiquitin D; Nuclear factor kappa B

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.011

國家自然科學基金面上項目(30770950)

400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院呼吸內科

李玉英， Email：zhlyyhy@163.com

R563

A

2017-02-08)