神經生長因子通過c-fos促進支氣管上皮細胞NK-1R表達

李志芳 秦嶺 賀若曦 胡新月 湯渝玲 胡成平 馮俊濤

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·論著·

神經生長因子通過c-fos促進支氣管上皮細胞NK-1R表達

李志芳1秦嶺1賀若曦1胡新月1湯渝玲2胡成平1馮俊濤1

目的探討神經生長因子(NGF)通過c-fos影響支氣管上皮細胞NK-1R的表達。方法 以人支氣管上皮細胞(NHBEC)為研究對象，通過陽離子脂質體將c-fos siRNA 轉染至細胞內，然后用NGF干預。實驗設五組：對照組、NGF干預組、NGF+c-fos siRNA組、NGF+空白脂質體組、NGF+非特異性dsRNA組。轉染12 h后，用NGF干預60 min，采用 Western blot法測定c-fos蛋白表達，采用免疫細胞化學法和RT-PCR從蛋白和mRNA水平觀察細胞中NK-1R的表達。結果與對照組比，NGF組c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達均明顯增加(P<0.01)；與NGF組比，NGF+c-fos siRNA組中c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達均明顯減少(P<0.01)，而NGF組、NGF+空白脂質體組、NGF+非特異性dsRNA組之間的c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達無顯著差異。結論NGF可通過c-fos促進支氣管上皮細胞中NK-1R的表達，介導哮喘神經源性炎癥，RNAi技術可以減少NGF誘導的人支氣管上皮細胞c-fos蛋白及NK-1R的表達。

支氣管哮喘； 神經生長因子； c-fos； NK-1R

神經生長因子(nerve growth factor, NGF)是參與調節哮喘中神經-內分泌-免疫網絡失衡機制的重要因素[1-2]。哮喘發病過程中，NGF刺激神經節使感覺神經肽(sensory nerve peptide, SP)合成增多，隨后SP由神經突觸分泌并作用于氣道上皮細胞，導致神經源性炎癥的產生。此外，在NGF作用下，分布在支氣管上皮細胞表面的SP的主要受體NK-1R表達也明顯增強[3-5]。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路是迄今為止研究最為透徹的一條通路，它參與了支氣管哮喘發病的多個關鍵過程。本研究組前期的研究結果提示NGF可上調支氣管上皮細胞內神經源性炎癥的信號轉導通路Ras/MAPK/c-fos的表達來介導哮喘神經源性炎癥[6]。而在對大鼠紋狀體內源性鎮痛機制的研究中發現，c-fos與NK-1R的表達量呈正相關[7]。因此，本研究中我們選定下游信號分子c-fos作為研究靶點，構建特異性siRNA抑制c-fos表達，從正反兩方面觀察NGF是否通過c-fos影響支氣管上皮細胞NK-1R的表達。為探索NGF參與的哮喘神經源性機制提供理論依據和研究線索。

材料與方法

一、 材料與試劑

siRNA合成試劑盒(美國Ambion公司)、DMEM培養基(美國Hycolone公司)；Pgenesil-1質粒表達載體(武漢晶賽生物工程公司)及酶類：BamHI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、EcoRI(New England Biolabs)。線性化Pgenesil-1質粒表達載體及酶類：T4 DNA Ligase、BamHI、HindⅢ、SalI、PstI、EcoRI、XbaI、SacI(NEB公司)。siRNA熒光素標記試劑盒及RNaseZap(美國Ambion公司)；人支氣管上皮細胞株(NHBEC)(湖南遠泰生物工程公司)；大腸桿菌(DH5α)(武漢晶賽生物工程公司)；HindⅢ Marker、EcoT-14 I Marker、DL2000 Marker(New England Biolabs)；NK-1R的引物和擴增β-Actin(武漢伯杰生物工程公司)，rTaq、dNTP、Oligo dT、Trizol(New England Biolabs公司)；PD98059、AG490、NGF及 PMA (美國Sigma公司)；Western blot用兔抗人Anti-c-fos抗體、Anti-GAPDH，羊抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)，ECL Western blot檢測試劑盒(美國Santa Cruz公司)；免疫組化用兔抗人Anti-NK-1R抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，羊抗兔IgG(武漢博士德生物有限公司)，SABC免疫組化試劑盒。

二、實驗方法

1. 細胞培養: 人支氣管上皮細胞株(normal human bronchial epithelial cells, NHBEC)用10%胎牛血清的DMEM培養基(內含100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)在37 ℃，5% CO2環境下培養，隔天換液，顯微鏡下查看細胞生長情況，當細胞長至基質的70%～80%表面面積時予以傳代。將一部分細胞傳代至六孔板中培養，剩下的細胞繼續于50 cm3培養瓶內培養，當細胞長至基質的75%表面面積時進行干預試驗。

2. 小干擾RNA(siRNA)的確定及合成: 通過Ambion公司提供的工具把特異針對人bcl xL基因的siRNA靶序列挑選出來,依據Tuschl設計siRNA的方法,選定siRNA序列如下：CTG CTT ACA CGT CTT CCT T，再使用沉默小干擾RNA合成試劑盒合成siRNA。實驗操作按照試劑盒配套的工作手冊進行。將體外轉錄合成的siRNA根據配套手冊中的方法用紫外分光光度計定量，具體如下：①將少量siRNA樣品和三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸電泳緩沖液按1︰25比例混合,隨后用紫外分光光度計測量3次A260吸光度值,取平均數；②用公式siRNA濃度(μmol/L)=檢測液A260×1 000/143計算siRNA濃度；③用熒光素標記，標記后，-70 ℃保存備用。

3. siRNA-脂質體轉染： 以脂質體為載體，將沉默c-fos表達的特異性siRNA轉染至NHBEC。采用0.3%胰酶消化對數生長期的細胞5 min后，DMEM培養液終止，以離心半徑8 cm，1 000 r/min 離心10 min后棄上清，用適量PBS重懸細胞。通過自動細胞計數板計數來調整細胞濃度,將細胞懸液接種到新的培養瓶。在含10%胎牛血清DMEM中，37 ℃、5% CO2條件下,培養至18%～60%的融合率。把轉染液配制的陽離子脂質體液分別與siRNA和dsRNA(非特異性)混合，使脂質體充分包裹，再加入細胞中轉染20 h。

4. 熒光顯微鏡下觀察轉染效率: 將熒光素標記的siRNA轉染至NHBEC內，當終濃度達到50 nmol/L時在避光條件下孵育48 h，隨后用4 ℃ PBS洗滌3次，消化收集細胞，涂片，通過熒光顯微鏡查看綠色熒光細胞。

5. 實驗分組及細胞干預: 細胞轉染前1 d將細胞接種于6孔培養板，待細胞融合達50%～80%，將培養基換成無血清DMEM，并進行細胞轉染。分組和干預如下：①對照組：加入500 μl無血清DMEM；②NGF組：加入100 ng/ml NGF干預60 min；③NGF+dsRNA組：加入非特異性dsRNA脂質體復合物500 μl預刺激后，再加入100 ng/ml NGF干預60 min后收獲細胞；④NGF+siRNA組：加入500 μl c-fos siRNA脂質體復合物預刺激后，再加入100 ng/ml NGF干預60 min；⑤NGF+空白脂質體組：加入250 μl脂質體稀釋液及25 μl無血清DMEM預刺激后，再加入100 ng /ml NGF干預60 min。每組3個復孔，顯微鏡下查看細胞形態變化。提取細胞總蛋白及RNA備用。

6. 應用western-blot測定細胞c-fos蛋白含量: 經上述分組干預后，將NHBEC刮下，以離心半徑8 cm，1 000 r/min 離心10 min，隨后將細胞移至EP管中。依照細胞數加裂解液裂解30 min(冰上進行)。4 ℃，以離心半徑8 cm 13 000 r/min 離心20 min，取上清，用Bradford法檢測蛋白質濃度。200 V電壓下12%聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h。100 V下電轉移1 h，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。兔抗人c-fos抗體(1︰500稀釋)孵育2 h，羊抗兔IgG(1︰1 000稀釋)孵育1 h，配置ECL試劑盒工作液，顯示蛋白條帶，定影。顯帶的X線片在凝膠成像分析系統上分析，得出每條帶的積分光密度(integral optical density, IOD)值。

7. RT-PCR方法測定細胞內NK-1R mRNA的表達: 用Trizol提取細胞總RNA，采用2 μl AMV逆轉錄酶反應體系將mRNA逆轉錄合成第一條互補DNA(cDNA)，再以此為模板進行RT-PCR反應操作。NK-1R引物序列：上游 5′-GGG ACT CCT CTG ACC GCT AC-3′；下游 5′-TCC AGG CGG CTG ACT TTG TA-3′，片段長度376 bp (753～1 128)。β-Actin引物序列：上游 5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′；下游 5′-GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3′，產物長度204 bp(867～1 070)。反應條件：95 ℃變性10 min；94 ℃ 30 s，70 ℃(-2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，5個循環后，再94 ℃ 30 s，55 ℃(+0.2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環。

8. 間接法(免疫細胞化學)檢測NK-1R在細胞內的表達： 細胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌3次，5 min/次，然后加入1︰200一抗(Anti-NK-1R)，4 ℃過夜。PBS洗滌3次，5 min/次，滴加1︰100二抗，37 ℃溫箱中孵育30 min。PBS洗滌3次，5 min/次，DAB顯色試劑進行顯色，蒸餾水洗滌3次，3 min/次，50 %緩沖甘油(將純甘油與0.5 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液按照1︰1體積比充分混勻)封片，200倍顯微鏡下觀察。采用IPP6.0軟件分析各組NK-1R的表達強度：以細胞胞漿或核中出現棕黃色產物為陽性反應。免疫組化結果采用定性分析[8]，陰性(-)：陽性細胞數<5 %；弱陽性(+)：陽性細胞數5%～25%；中度陽性(++)：陽性細胞數26%～50%；強陽性(+++)：陽性細胞數>50%。

三、統計學方法

結 果

一、細胞的一般情況

光鏡下顯示NHBEC轉染各組試劑后，生長活躍，細胞形態正常。siRNA轉染組以細胞內出現清晰的綠色熒光為轉染成功，轉染效率達到80%以上。

二、Western-blot測定細胞c-fos蛋白含量

與對照組相比，NGF干預后c-fos蛋白表達明顯增加。如圖中顯示NGF組、NGF+dsRNA組、NGF+空白脂質體組的c-fos蛋白表達均明顯強于對照組，P<0.01；與單純NGF干預組相比，NGF+siRNA組的c-fos表達水平明顯減少(P<0.01)。而dsRNA和脂質體組的c-fos表達量與單純NGF干預組無明顯差異，見圖1，表1。

圖1 Western-blot 半定量檢測c-fos蛋白表達；注：1和2：NGF 組；3和4：NGF+siRNA組；5和6：對照組

表1 Western-blot 半定量檢測c-fos蛋白表達

注：與對照相比aP<0.01；與NGF組相比bP<0.01

三、RT-PCR方法測定細胞內NK-1R mRNA的表達

與對照組比，NGF作用1 h后，NK-1R mRNA表達水平顯著增高，圖中可見NGF組、NGF+dsRNA組、NGF+空白脂質體組的NK-1R mRNA表達均明顯強于對照組(P<0.01)。c-fos siRNA可抑制NGF誘導NHBEC表達NK-1RmRNA，即NGF+siRNA組的 NK-1RmRNA 表達水平要明顯低于 NGF 干預組(P<0.01)。而dsRNA和脂質體均無此抑制作用，見圖2。

圖3 免疫細胞化學法觀察NK-1R表達；注：A: 對照組 (SABC×200)；B: NGF組 (SABC×200)；C：NGF+空白脂質體組(SABC×200)；D：NGF+siRNA組 (SABC×200)；E：NGF+dsRNA組 (SABC×200)

圖2 RT-PCR半定量檢測NK-1R mRNA表達；注：與對照相比*P<0.01；與NGF組相比#P<0.01

四、間接法(免疫細胞化學)檢測NK-1R在細胞內的表達

NK-1R陽性產物為棕黃色顆粒，以胞漿表達為主。對照組無明顯的NK-1R表達，為陰性反應，NGF組及NGF+空白脂質體組為強陽性反應，NGF+非特異dsRNA組呈陽性反應，而NGF+siRNA組表達明顯減少，為弱陽性反應。提示NGF可以刺激NHBEC表達NK-1R，而c-fos siRNA可以抑制NGF對NHBEC內NK-1R表達的刺激作用，見圖3。

討 論

支氣管哮喘是肺部最常見的慢性炎癥性疾病，其發病機制與氣道炎癥，氣道高反應性及氣道重塑相關[9-12]。支配氣道的感覺神經及其相關營養因子與氣道炎癥的形成密切相關[13-15]。目前已知與哮喘密切相關的感覺神經肽有P物質(substance P, SP)、神經激肽A(neurokinin A, NKA)、神經激肽B(neurokinin B, NKB)等[16-17]，它們通過與相應的受體結合而促發氣道神經源性炎癥[18]。

既往研究證實，哮喘大鼠肺組織中NGF明顯增多，并參與氣道源性炎癥[19]。在NGF的作用下，SP及其主要受體 NK-1R的表達也顯著增多。在本研究中，NGF對NK-1R表達的促進作用再次得到證實。而在對大鼠紋狀體內源性鎮痛機制的研究中發現，c-fos與NK-1R的表達量呈正相關 ,依據以上線索，我們推測NGF可能是通過活化MAPK通路中的c-fos信號分子，進而促進支氣管上皮細胞中NK-1R的表達的，并構建siRNA阻斷c-fos表達，從反方向對上述假說加以驗證。

本研究觀察到，經NGF干預后，NHBEC中c-fos蛋白的表達較對照組明顯增多，這與我們之前的研究結果基本一致[6]，同時RT-PCR和免疫細胞化學結果提示NGF可以促進NK-1R在支氣管上皮細胞中的表達，這說明NGF不但能通過促進P物質的釋放[20]，還能刺激其受體在支氣管上皮細胞的表達來參與氣道神經源性炎癥。為明確NGF是否通過c-fos蛋白來調控NK-1R的表達，我們用siRNA沉默c-fos基因表達，結果表明，當c-fos基因未阻斷時，NGF作用后NK-1R表達明顯增強，而用siRNA阻斷c-fos基因后，NGF對NK-1R表達的促進作用受到抑制。提示NGF對NK-1R表達的促進作用是通過c-fos蛋白實現的。已知c-fos是Ras/MAPK通路中的重要下游蛋白，因此NGF對NK-1R表達的促進作用很可能是通過活化Ras/MAPK/c-fos信號通路來實現的。

綜上所述，本研究發現NGF可通過c-fos促進支氣管上皮細胞中NK-1R的表達，進而介導哮喘神經源性炎癥。應用RNAi技術可以減少NGF誘導的人支氣管上皮細胞c-fos蛋白及NK-1R的表達。本研究結論為哮喘的機制研究和治療靶點提供了新的線索。

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(本文編輯：張大春)

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Nerve growth factor stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos

LiZhifang1,QinLing1,HeRuoxi1,HuXinyue1,TangYuling2,HuChengping1,FengJuntao1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China

HuChengping,Email：huchengp28@126.com

Objective To investigate whether the effect of nerve growth factor on NK-1R expression of bronchial epithelial cells is via c-fos. Methods Human bronchial epithelial cells (NHBEC) were taken as the research object, the c-fos siRNA was transected into cells through the positive ion fat plastid, and then the NGF intervention was carried on. The control group, NGF intervention group, NGF+c-fos siRNA group, NGF+ liposomes group, NGF+non-specific dsRNA group were decided. After trans-infection for 12 h and then intervention for 60min, the protein expression of c-fos was detected by western-blot. The protein and mRNA expression of NK-1R was determined by RT-PCR and immune cell chemical definite quality respectively. Results Compared with the control group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly increased in NGF group (P<0.01); compared with NGF group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly reduced in NGF+c-fos siRNA group (P<0.01), NGF intervention group, NGF+liposomes group, NGF+ non-specific dsRNA group had no significant difference in the expression of them. Conclusion NGF stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos. and then mediate neurogenic inflammation of asthma. RNAi could reduced the of c-fos protein and NK-1R induced by NGF in human bronchial epithelial cells.

Bronchial asthma; Nerve growth factor; C-fos; NK-1R

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.007

國家自然科學基金資助項目(81400022,81270080)

410008 長沙，中南大學湘雅醫院呼吸科1410005 長沙，長沙市第一醫院呼吸科2

胡成平，Email：huchengp28@126.com

R563

A

2017-01-17)