“體驗(yàn)細(xì)胞融合過(guò)程簡(jiǎn)易方法”實(shí)驗(yàn)教學(xué)的設(shè)計(jì)與組織

李英芳 周有祥

（北京市昌平區(qū)第一中學(xué) 北京 102200）

學(xué)生在必修1《分子與細(xì)胞》模塊中已經(jīng)明確了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、功能及制備方法，但在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法觀察到細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，學(xué)生根據(jù)細(xì)胞融合前、后的形態(tài)變化，可以更好地體驗(yàn)細(xì)胞膜的存在及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。學(xué)生在前期已經(jīng)學(xué)習(xí)了細(xì)胞膜及植物原生質(zhì)體的融合等知識(shí)，但對(duì)于膜的具體融合過(guò)程依然缺少主觀體驗(yàn)。本節(jié)課是在雞血細(xì)胞融合的方法上進(jìn)行簡(jiǎn)化，逐步拓展為人血細(xì)胞融合、Hela細(xì)胞、Vero細(xì)胞融合的簡(jiǎn)易方法，方便學(xué)生操作與觀察結(jié)果，且縮短操作時(shí)間，保證學(xué)生在一節(jié)課內(nèi)達(dá)到理論與實(shí)踐的有機(jī)結(jié)合。采用探究實(shí)驗(yàn)為主線的方法，引導(dǎo)學(xué)生更深入地理解學(xué)科本質(zhì)，體會(huì)單克隆抗體制備的過(guò)程，學(xué)生圍繞已有的知識(shí)基礎(chǔ)，從應(yīng)用層面進(jìn)行深入思考并分析對(duì)比。

1 學(xué)情分析

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，這是細(xì)胞融合、生物膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。人教版選修3《現(xiàn)代生物科技專題》模塊的植物體細(xì)胞雜交、動(dòng)物細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的形成、細(xì)胞核移植（完整的體細(xì)胞與去核的次級(jí)卵母細(xì)胞）均涉及了細(xì)胞融合技術(shù)。而單克隆抗體的制備是細(xì)胞融合技術(shù)實(shí)際應(yīng)用的絕佳范例，在教材中具有重要地位。學(xué)生通過(guò)設(shè)計(jì)單克隆抗體的制備方案，逐步過(guò)渡到對(duì)細(xì)胞融合過(guò)程的關(guān)注，進(jìn)而開(kāi)展相關(guān)的設(shè)計(jì)與探究活動(dòng)。最終將探究的結(jié)果進(jìn)行有效分析并與核心概念進(jìn)行有機(jī)整合，從而突出學(xué)科特點(diǎn)，并加深對(duì)單克隆抗體制備過(guò)程的理解。

2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1 試劑準(zhǔn)備

GKN液：氯化鈉8 g，氯化鉀0.4 g，磷酸氫二鈉 1.77 g，磷酸二氫鈉 0.69 g，葡萄糖 2 g，酚紅0.01 g，溶于1 000 mL重蒸水中。

PEG混合液：稱取適量PEG（分子量為 4 000或20 000）放入帶刻度離心管并于沸水浴中加熱溶化，待冷卻至50℃時(shí)，加入預(yù)熱至50℃的GKN液，混勻制成20%、30%、40%、50%的PEG溶液。

Alsever液：葡萄糖 2.05 g，檸檬酸鈉 0.8 g，氯化鈉0.42 g，加重蒸水至100 mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料 雞血細(xì)胞（課前取血）、人紅細(xì)胞（自采）、Hela細(xì)胞和Vero細(xì)胞（由本校京北分子與細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供：先用PBS清洗2次，干凈后用胰蛋白酶消化，加少量培養(yǎng)液制成適宜濃度的細(xì)胞懸浮液備用）。

2.3 設(shè)備準(zhǔn)備 電子天平、載玻片、蓋玻片、滴管、燒杯、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、熒光倒置顯微鏡、移液槍、槍頭、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、試管架、電腦、顯微鏡、鐵架臺(tái)、酒精燈、采血針、毛細(xì)吸管、酒精棉球、PC管、刀、量筒等。

2.4 實(shí)驗(yàn)安全培訓(xùn) 因涉及自采血的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，故進(jìn)行必要的課前安全培訓(xùn)，特別注意以下幾點(diǎn)：1）查看一次性用品是否破損；2）采血前用酒精棉球充分消毒（實(shí)驗(yàn)室環(huán)境已經(jīng)紫外消毒）；3）用干凈的毛細(xì)吸管采血1～2滴后及時(shí)將血放入Alsever液內(nèi)，防止凝血；4）采血后立即止血，不要著水；5）所有采血用品均為一次性使用，使用完畢放入廢液缸，同時(shí)提醒組長(zhǎng)根據(jù)組員特點(diǎn)進(jìn)行組內(nèi)分工，按照自愿的原則協(xié)調(diào)好進(jìn)行采血的學(xué)生。

3 教學(xué)過(guò)程的組織與實(shí)施

3.1 導(dǎo)入 各小組依據(jù)課前準(zhǔn)備的“單克隆抗體制備”的方案設(shè)計(jì)，進(jìn)行設(shè)計(jì)方案展示與相互評(píng)價(jià)，并分析比較，得出現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下可行的方案及簡(jiǎn)單步驟（板書(shū)輔助“單抗制備流程圖”）。教師進(jìn)一步指出細(xì)胞融合是其中重要一環(huán)，引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，再進(jìn)行小組分工實(shí)施。

設(shè)計(jì)意圖：培養(yǎng)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力，提高學(xué)科素養(yǎng)，并通過(guò)分析辯論更好地體現(xiàn)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，提升解決問(wèn)題的靈活性，同時(shí)提高學(xué)生的表述能力。

3.2 實(shí)驗(yàn) 教師準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)材料，讓各組自愿選擇，提醒學(xué)生注意實(shí)驗(yàn)安全，觀察每組實(shí)驗(yàn)情況，及時(shí)指導(dǎo)（操作規(guī)范、試劑用量、細(xì)胞濃度）并記錄問(wèn)題。學(xué)生分組自主選擇材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組提供20%、30%、40%、50%不同分子量的PEG溶液。由于課堂時(shí)間有限，2個(gè)小組進(jìn)行人血融合實(shí)驗(yàn)，同時(shí)另外4個(gè)小組進(jìn)行Hela細(xì)胞與Vero細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)。

設(shè)計(jì)意圖：學(xué)生通過(guò)親身設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，進(jìn)一步感受生物學(xué)的核心思想，得出促進(jìn)細(xì)胞融合的適宜PEG的體積分?jǐn)?shù)與分子量，為學(xué)習(xí)單克隆抗體的制備打下基礎(chǔ)。

3.2.1 創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案1：雞血融合方法

教師展示實(shí)驗(yàn)過(guò)程片段與結(jié)果，學(xué)生指出本方案的不足之處，依此為依據(jù)和參照，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新與改進(jìn)。

3.2.2 創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案2：人血融合方法

3.2.3 創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案3：Hela細(xì)胞與Vero細(xì)胞融合方法

教師與學(xué)生一起分享實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行結(jié)果匯總與數(shù)據(jù)分析。在表1中進(jìn)行簡(jiǎn)單記錄。學(xué)生總結(jié)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)步驟，得出促進(jìn)細(xì)胞融合的適宜PEG的體積分?jǐn)?shù)與分子量。

設(shè)計(jì)意圖：提高學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析處理能力，進(jìn)而得出相應(yīng)結(jié)論。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄表

3.3 提升總結(jié) 教師闡明單克隆抗體制備的過(guò)程，指出此過(guò)程需要注意的知識(shí)點(diǎn)，以問(wèn)題串的形式呈現(xiàn)：細(xì)胞兩兩融合的情況有哪些？第1次篩選的目的和原理分別是什么？第2次篩選的目的和原理分別是什么？學(xué)生思考、討論相關(guān)問(wèn)題，構(gòu)建相關(guān)流程圖，并關(guān)注各操作要點(diǎn)的原理。

設(shè)計(jì)意圖：既關(guān)注科學(xué)過(guò)程的整體，又留意其具體細(xì)節(jié)，培養(yǎng)學(xué)生思維的縝密性。

3.4 遷移反饋 教師提問(wèn)：你剛剛設(shè)計(jì)并完成的實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)實(shí)生活中有什么實(shí)際意義？舉例說(shuō)明，并說(shuō)明設(shè)計(jì)理由（可以說(shuō)出你的任何想法：例如骨髓瘤細(xì)胞與胰島B細(xì)胞融合可行嗎？），引導(dǎo)學(xué)生思考，但最終要回歸到已經(jīng)成功制備單抗的過(guò)程。學(xué)生表達(dá)自己想法。

設(shè)計(jì)意圖：通過(guò)聯(lián)系生活，激發(fā)學(xué)生對(duì)知識(shí)與技能學(xué)以致用的思考，同時(shí)在遷移中獲得反饋，檢測(cè)課堂效果，針對(duì)問(wèn)題及時(shí)解決。

3.5 效果評(píng)價(jià) 學(xué)生設(shè)計(jì)細(xì)胞融合的過(guò)程，然后進(jìn)行討論后確定實(shí)驗(yàn)方案，自己在動(dòng)手實(shí)驗(yàn)中感受細(xì)胞融合的狀態(tài)，學(xué)生的探究熱情高漲，對(duì)于促融的方法及過(guò)程理解更加透徹，對(duì)單克隆抗體的制備過(guò)程也更加清晰。同時(shí)對(duì)相關(guān)探究活動(dòng)的方法步驟分析進(jìn)行有效整合，學(xué)生加深了對(duì)實(shí)驗(yàn)本質(zhì)及生物學(xué)科核心思想的理解。以下是學(xué)生部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖:

圖1 20%PEG20000促融人紅細(xì)胞（細(xì)胞未發(fā)生融合，但細(xì)胞表面發(fā)生了明顯變化）

圖2 30%PEG20000促融人紅細(xì)胞（細(xì)胞之間有了接觸，但融合與否不明顯）

圖3 40%PEG20000促融人紅細(xì)胞（細(xì)胞出現(xiàn)了兩兩融合，甚至出現(xiàn)了多個(gè)細(xì)胞的融合）

圖4 30%PEG20000促融Hela細(xì)胞（細(xì)胞融合比較明顯）

圖5 40%PEG4000促融Hela細(xì)胞（細(xì)胞融合明顯）

圖6 40%PEG4000促融Vero細(xì)胞（細(xì)胞融合明顯）

4 結(jié)語(yǔ)

本節(jié)課采用探究實(shí)驗(yàn)為主線的方法，增加了學(xué)生動(dòng)手與動(dòng)腦的機(jī)會(huì)，引導(dǎo)學(xué)生圍繞已有的知識(shí)基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，學(xué)生在親自實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上有利于對(duì)知識(shí)的理解與實(shí)際應(yīng)用，從探究PEG對(duì)細(xì)胞融合的影響到體會(huì)單克隆抗體制備的過(guò)程，啟發(fā)學(xué)生從應(yīng)用層面進(jìn)行深入思考分析，促進(jìn)思維遷移，整個(gè)教學(xué)過(guò)程設(shè)計(jì)致力于學(xué)科本質(zhì)的凸顯和學(xué)生能力的提高。

盡管如此，以下2點(diǎn)依然值得商榷：

1）及時(shí)發(fā)現(xiàn)課堂生成的問(wèn)題。例如課下交流時(shí)，課堂上有學(xué)生提出“是否可以將人血細(xì)胞和Hela細(xì)胞進(jìn)行融合”。

2）適當(dāng)引導(dǎo)學(xué)生探究結(jié)果分享。讓學(xué)生更準(zhǔn)確全面闡述其發(fā)現(xiàn)與思考。

［1］王惠，郭峰，關(guān)超，等.PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合最適條件的探討.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：145.

［2］趙彥禹，張艷華，馮照軍.雞紅細(xì)胞融合最適條件的探討.生物磁學(xué)，2006，6（1）：43.

［3］馬全祥，劉涌濤，姚開(kāi)輝，等.細(xì)胞融合教學(xué)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn).生物學(xué)通報(bào)，2001，36（8）：35.

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