黃秋葵多糖超聲波輔助提取工藝優化及其對·OH體外抗氧化活性研究

曾劍華，李加興，2，李 昀，關智謀，徐天豪

（1.吉首大學化學化工學院，湖南吉首416000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南長沙410008）

黃秋葵多糖超聲波輔助提取工藝優化及其對·OH體外抗氧化活性研究

曾劍華1，*李加興1，2，李 昀1，關智謀1，徐天豪1

（1.吉首大學化學化工學院，湖南吉首416000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南長沙410008）

以黃秋葵干果莢為原料，選用超聲輔助手段對提取其多糖工藝進行優化。采用單因素試驗探討了超聲溫度、超聲時間、液料比和超聲功率對黃秋葵干果莢多糖提取得率的影響，在此基礎上進行正交試驗以確定最佳工藝條件。研究結果表明，提取黃秋葵干果莢多糖的最佳工藝條件為超聲溫度60℃，超聲時間25 min，液料比40∶1（mL∶g），超聲功率90 W，在此條件下提取的黃秋葵干果莢多糖平均得率為3.53%（m/m）；制得的RPS對·OH的清除率隨著其質量濃度的增加而增大，IC50值為2.41±0.07 mg/mL，表現出較好的體外抗氧化活性。

黃秋葵；超聲波；提取；多糖；抗氧化

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）為錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Hibiscus Linn.）植物，別名羊角豆、咖啡黃葵、毛茄等，在我國各地區均有種植栽培。研究發現，黃秋葵果實富含氨基酸、維生素、礦物質元素、多糖及不飽和脂肪酸等，含有多種營養成分，其中含總糖19.92%，多糖2.00%，脂肪9.4%[1-2]。黃秋葵多糖能有效維持動脈血管的彈性及防止肝臟和腎臟中結締組織萎縮，同時具有體外結合膽酸的能力和增強機體的免疫力、抗疲勞等多種功效[3-4]。

近年來，國內對黃秋葵的研究主要集中于黃秋葵的栽培技術、食用價值與觀賞價值應用、食用品質提高與貯藏保鮮的生理研究、營養功效等成分提取工藝測定[6-8]。國內對黃秋葵多糖的超聲提取、水提工藝開展了相關研究[9-12]，結果表明超聲法比傳統的水提法更能有效縮減提取工藝周期，多糖提取率有明顯提高。但因各地區的黃秋葵原料多糖含量不一，即使同一地區的黃秋葵因采摘時間不一樣多糖含量也會不同，而且嫩果與干果莢的多糖含量也有很大差異；另一方面是采用的優化條件對得率也有一定的影響，導致得率相差比較大[13]。試驗以黃秋葵干果莢為原料，采用超聲波輔助提取技術，以增大多糖的溶出速度，探討超聲功率、超聲溫度等關鍵因素對黃秋葵干果莢多糖（RPS）提取得率的影響，通過正交試驗確定超聲波輔助提取黃秋葵干果莢多糖的最佳工藝條件，并以得到的RPS進行對·OH體外抗氧化活性研究，以期為黃秋葵深加工與綜合開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

JA-5113N型高精度電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司產品；TU-1900型紫外可見分光光度計、723可見分光光度計，上海菁華科技有限公司產品；SB-32NYDTD型超聲波清洗器，寧波新型生物科技有限公司產品；FZ102型微型植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；GZX9-146 MBE型數顯電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司產品；LXJ-lI B型飛鴿牌離心機，上海安亭科學儀器廠產品；溫度計；電爐；恒溫水浴鍋，上海寰熙醫療器械有限公司產品。

1.2 試驗材料

黃秋葵干果莢，湖南奇異生物科技有限公司提供，產地湖南瀏陽。

無水乙醇，分析純，湖南師范大學化學試劑廠提供；95%濃硫酸，分析純，阿拉丁試劑有限公司提供；苯酚、無水葡萄糖等，均為國產分析純試劑。

1.3 研究方法

1.3.1 提取工藝流程

黃秋葵干果莢→粉碎（過40目篩）→超聲浸提→紗布粗過濾→離心→酒精沉淀→離心→去除上清液→用蒸餾水定容→測定多糖含量。

1.3.2 超聲提取法操作要點

挑選干燥、無霉變的黃秋葵干果莢，經粉碎過40目篩后，精確稱取1.000 0 g樣品置于250 mL三角瓶內，加入設定比例的蒸餾水，將三角瓶放入超聲波清洗器內進行超聲提取，嚴格控制好超聲溫度、超聲時間和超聲功率，超聲提取結束后，用粗紗布過濾離心，經酒精沉淀后過夜，然后去除上清液，烘干沉淀物并定容于100 mL容量瓶中，最后于波長490 nm處測定樣品吸光度[11]，根據標準曲線計算多糖含量。

1.4 單因素試驗

1.4.1 液料比對黃秋葵干果莢多糖提取得率的影響

設定超聲溫度60℃，超聲時間20 min，超聲功率75 W，液料比分別設置為20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1（mL∶g）提取黃秋葵干果莢粗多糖（Raw polysaccharides，RPS），于波長490 nm處測定浸提液吸光度并計算RPS得率，以探討液料比對提取黃秋葵干果莢RPS得率的影響。

1.4.2 超聲時間對RPS提取得率的影響

設定液料比40∶1，超聲溫度60℃，超聲功率75 W，超聲時間設置為10，15，20，25，30 min提取RPS，于波長490 nm處測定浸提液吸光度并計算RPS得率，以探討超聲時間對RPS得率的影響。

1.4.3 超聲溫度對RPS提取得率的影響

設定液料比40∶1，超聲時間20 min，超聲功率75 W，控制超聲溫度分別為40，50，60，70，80℃提取RPS，在490 nm處測定浸提液吸光度并計算RPS得率，以探討超聲溫度對RPS得率的影響。

1.4.4 超聲功率對RPS提取得率的影響

設定液料比40∶1，超聲時間20 min，超聲溫度60℃，控制超聲功率分別為45，60，75，90，105 W提取RPS，在490 nm處測定浸提液吸光度并計算RPS得率，以探討超聲功率對RPS得率的影響。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取超聲溫度、超聲時間、液料比、超聲功率為影響黃秋葵干果莢粗多糖提取的主要因素，進行L9（34）優化試驗。

L9（34）正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平設計

1.6 分析檢測方法

1.6.1 苯酚-硫酸法制備葡萄糖標準曲線

依次吸取用蒸餾水配制的0.5 mg/mL D-葡萄糖標準溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL并分別置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，配成系列標準溶液。分別準確移取系列標準溶液2.0 mL于比色管中，同時吸取2 mL蒸餾水作為空白對照，然后分別加入1.5 mL 5%苯酚溶液，混合均勻后，快速加入6.5 mL 95%硫酸溶液，沸水浴中反應15 min，室溫放置30 min，于波長490 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、葡萄糖質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

根據圖1得到線性回歸方程Y=10.534 2X-0.034 7（R2=0.995 1），可見葡萄糖的質量濃度（X）在0～0.10 mg/mL范圍內與吸光度（Y）有良好的線性關系。

1.6.2 樣品多糖的計算方法

（1）樣品多糖質量。精確稱取1.000 0 g黃秋葵干果莢粉置于250 mL三角瓶中，加入適量蒸餾水，設置相應的提取參數，在超聲波清洗器內提取黃秋葵干果莢粗多糖（RPS），經過紗布過濾、離心、酒精沉淀過夜后再離心分離，去除上清液，待酒精揮發后，將提取得到的黃秋葵干果莢粗多糖用蒸餾水定容至100 mL，準確移取提取液2.0 mL于比色管中，加入1.5 mL 5%苯酚溶液，混合均勻后快速加入6.5 mL 95%硫酸溶液，沸水浴中反應15min，室溫放置30 min，于波長490 nm處測定吸光度，根據標準曲線求得樣品多糖的質量濃度，然后依據質量濃度算出樣品多糖的質量。

式中：m——RPS質量；

A——吸光度。

（2）RPS得率。

黃秋葵多糖（RPS）提取得率=

1.7 RPS對羥基自由基（·OH）的清除率

RPS對·OH的清除率試驗加樣見表2。

表2 RPS對·OH的清除率試驗加樣

采用Fenton反應法[14]。用蒸餾水將樣品原料溶解并稀釋成一系列質量濃度梯度：0.5，1，2，6，8，10 mg/mL，分別取上述質量濃度的多糖溶液1 mL于6支干燥試管中，按表2所示添加反應液，混勻，以抗壞血酸（VC）作陽性對照，無水乙醇∶去離子水=1∶3為空白液調零，用紫外分光光度計于波長510 nm處測定吸光度。

按公式（3）計算樣品對·OH的清除率：

式中：A0——蒸餾水代替樣品溶液時的吸光度；

A1——加入不同質量濃度樣品溶液后測得的吸光度；

A2——蒸餾水代替H2O2溶液時不同樣品質量濃度下測得的本底吸光度。

清除率為50%時，所對應黃秋葵多糖的質量濃度即為半數清除質量濃度IC50值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對黃秋葵干果莢多糖提取得率的影響試驗

液料比對RPS提取得率的影響見圖2。

圖2 液料比對RPS提取得率的影響

由圖2可知，隨著液料比增大，RPS提取得率有明顯增大趨勢，在液料比40∶1（mL∶g）左右達到最大值，然后降低，趨勢較平緩。這可能是因為隨著液料比增大，促成細胞壁內外多糖濃度差增大，增大了擴散速度，有利于多糖的溶出。當液料比達到一定程度后，因為超聲波能量有限，溶出膠質多糖達到飽和，導致細胞破碎不完全，且超聲能使膠質多糖分解[1]，從而導致多糖提取得率下降。因此，選擇液料比40∶1（mL∶g）左右效果較好。

2.1.2 超聲時間對RPS多糖提取得率的影響試驗

超聲時間對RPS提取得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對RPS提取得率的影響

由圖3可知，隨著超聲超聲時間的延長，RPS提取得率明顯增大，當時間超過20 min時，多糖提取得率開始下降。這可能是因為開始時超聲時間過短，多糖溶出不充分，當達到一定超聲時間后，隨著超聲時間的延長，超聲波對多糖的糖苷鍵降解程度加大[15]，從而造成提取率得下降。由此可以看出，過多延長超聲時間會消耗更多的資源，還增加了生產成本。因此，選擇超聲時間以20 min為宜，不但縮短工藝周期，而且得率較高。

2.1.3 超聲溫度對RPS提取得率的影響試驗

超聲溫度對RPS提取得率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，多糖提取得率急劇上升，但在60℃之后開始降低。其原因可能是升高溫度雖然可以增加多糖的溶出速度，但是高溫下會破壞多糖結構而不利于多糖的提取[16]，因此超聲溫度選在60℃左右，不但得率較高，還可以節約能源，降低生產成本。

2.1.4 超聲功率對RPS提取得率的影響試驗超聲功率對RPS提取得率的影響見圖5。

圖4 超聲溫度對RPS提取得率的影響

圖5 超聲功率對RPS提取得率的影響

由圖5可知，在超聲功率小于90 W時，RPS提取得率隨著超聲功率的增大而增大，并且在90 W附近出現最大值，而后隨著超聲功率進一步增大略有下降。原因可能是因為開始提取時隨著超聲能量增大，溶出多糖的飽和能力進一步提高，但是當超聲功率達到一定值以后，超聲波就會破壞多糖結構而引起多糖降解[16]，造成多糖提取得率下降。因此，選擇超聲功率在90 W左右較為適宜。

2.2 正交試驗結果與分析

L9（34）正交試驗結果與分析見表3。

表3 L9（34）正交試驗結果與分析

由表3極差R可知，影響黃秋葵干果莢RPS提取的4個因素主次順序為C＞D＞A＞B，最優水平為A2B3C2D2，即超聲溫度60℃，超聲時間25 min，液料比40∶1（mL∶g），超聲功率90 W。按照最優水平A2B3C2D2組合進行3次平行試驗。

最優水平驗證試驗結果見表4。

表4 最優水平驗證試驗結果

由表4可知，RPS提取得率均值為3.53%，略高于正交試驗結果，說明該工藝條件可行。

2.3 黃秋葵多糖對·OH的體外抗氧化活性

RPS質量濃度對·OH清除能力的影響見圖6。

圖6 RPS質量濃度對·OH清除能力的影響

由圖6可知，隨著RPS質量濃度的增加，樣品對·OH的清除能力呈上升趨勢，在試驗樣品質量濃度范圍內呈現出良好的線性關系，體現出較強的抗氧化活性，清除·OH的IC50值為2.41 mg/mL。但RPS的抗氧化活性低于對照樣VC，VC清除·OH的IC50值為0.08 mg/mL。

3 結論

以黃秋葵干果莢為原料，對其多糖超聲輔助水提工藝進行優化，選取超聲溫度、超聲時間、液料比和超聲功率為影響因素，在單因素基礎上進行L9（34）正交試驗，得出的最佳工藝條件為超聲溫度60℃，超聲時間25 min，液料比40∶1（mL∶g），超聲功率90 W；在此條件下，黃秋葵干果莢多糖平均提取得率可達3.53%（m/m）；制得的RPS對·OH的清除率隨著其質量濃度的增加而增大，IC50值為2.41 mg/mL，表現出較好的體外抗氧化活性。

[1]田科巍.黃秋葵油脂及多糖提取工藝優化和組分分析[D].合肥：合肥工業大學，2012.

[2]趙煥煥.黃秋葵多糖提取純化及體外抗氧化活性的探討[D].蘭州：蘭州大學，2012.

[3]任丹丹，陳谷.黃秋葵多糖的提取、分離及其體外結合膽酸鹽能力的分析[J].食品科學，2010，31（13）：110-113.

[4]郭新竹，寧正祥.天然酚類化合物及其保健作用[J].食品工業，2002（3）：28-29.

[5]高玲，劉迪發，徐麗.黃秋葵研究進展與前景[J].熱帶農業科學，2014，34（11）：22-29.

[6]Lai X，Liang H，Zhao Y，et al.Simultaneous determination of seven active flavonols in the flowers of Abelmoschus manihot by HPLC[J].J Chromatogr Sci.，2009，47（3）：206-210.

[7]Wu L L，Yang X B，Huang Z M，et al.In vivo and in vitro antiviral activity of hyperoside extracted from Abelmoschus manihot（L）.[J].Acta Pharmacol Sic.，2007，28（3）：404-409.

[8]Liu I M，Zeng T F，Liu S S，et al.Improvement of insulin sensitivity in obese Zucker rats by myricetin extracted from Abelmoschus moschatus[J].Planta Med，2007，73（10）：1 054-1 058.

[9]任丹丹，陳谷.響應面法優化黃秋葵多糖超聲提取工藝[J].食品科學，2013，34（8）：143-147.

[10]高愿軍，幸美佳，周靖琦，等.2種方法提取秋葵多糖工藝研究[J].食品科技，2013，38（11）：189-192.

[11]劉怡彤，段振華，馬華林，等.超聲波輔助提取黃秋葵多酚和多糖的工藝研究[J].食品工業科技，2013，34（21）：247-253.

[12]黃誠，喻曉梅，尹紅.超聲波提取黃秋葵多糖的工藝條件研究[J].食品科學，2015，36（11）：299-301.

[13]張紅瑞，何立威，扶勝蘭，等.黃秋葵不同組織總黃酮與粗多糖含量的比較[J].信陽農林學院學報，2015，25（3）：95-98.

[14]張佳艷，熊建文.多糖抗氧化能力體外測定方法研究進展[J].糧食科技與經濟，2013，38（6）：26-29.

[15]徐建國，田呈瑞，胡慶平，等.響應面法優化槐花水溶性多糖的超聲波輔助提取工藝[J].食品科學，2011，32（4）：112-116.

[16]王曉陽，唐琳，趙壘.響應面法優化刺槐花多酚的超聲提取工藝[J].食品科學，2011，32（2）：66-70.◇

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Conditions and Study on·OH Antioxidant Activity of Polysaccharides from Okra

ZENG Jianhua1，*LI Jiaxing1，2，LI Yun1，GUAN Zhimou1，XU Tianhao1
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416008，China；2.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

Taking dried okra as raw material，the polysaccharides is extracted by the ultrasonic method to optimize the extraction process conditions in this paper.The effects of ultrasound treatment time，ultrasound temperature，material liquid ratio and ultrasonic power were studied through Single-factor experiment.Based on the results，the optimal extraction process conditions were determined vied orthogonal experiments as follows：ultrasound temperature 60℃，ultrasound treatment time 25 min，material liquid ratio 40∶1 and ultrasound power 90 W.Under these conditions，the extraction yield of polysaccharides from dried okra are reached to 3.53%（m/m）.In hydroxyl，scavenging assay，the IC50of the RPS extracted from dried okra is 2.41±0.07 mg/mL，which show good ability to against·OH.

okra；ultrasonic wave；extraction；polysaccharides；antioxidant activity

TS255.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.013

1671-9646（2017）03a-0044-04

2017-02-07

湖南省科技廳2015年重點研發計劃項目（2015NK3018）；吉首大學2016年校級本科生項目（JDX16001）。

曾劍華（1995—），男，在讀本科，研究方向為食品質量與安全。

*通訊作者：李加興（1969—），男，博士，教授，研究方向為植物資源開發利用與功能性食品研究。