云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝優(yōu)化

張?jiān)弃Q，付曉萍，林 奇，楊 艷，韓中惠，尹 雄，范江平

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南昆明650201）

云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝優(yōu)化

張?jiān)弃Q，付曉萍，林 奇，楊 艷，韓中惠，尹 雄，*范江平

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南昆明650201）

云南小粒種咖啡果皮粗提物含有花色苷，具有較好的抗氧化活性。利用響應(yīng)曲面法，研究云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)及料液比為自變量，采用響應(yīng)曲面法研究各因素及其交互作用對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物提取的影響。模擬得到云南小粒種咖啡果皮粗提物提取工藝的回歸方程，確定了提取工藝的最佳提取條件為提取時(shí)間120 min，提取溫度40℃，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20。在此提取工藝下可以較好地對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物進(jìn)行提取，為后期花色苷分離作好準(zhǔn)備。

云南小粒種咖啡；咖啡果皮提取工藝；響應(yīng)曲面

0 引言

云南省是我國(guó)主要的咖啡種植地，主要種植的品種是小粒種咖啡，也稱為云南小粒種咖啡[1-3]。由于云南省地形起伏較大，多以山區(qū)地形為主，空氣濕度較大，日照時(shí)間長(zhǎng)，晝夜溫差較大，這些自然條件使云南省成為種植小粒種咖啡的絕佳地帶之一，種植的小粒種咖啡酸味適中、香味濃郁醇和[4-5]。近年來(lái)，云南省政府和有關(guān)部門(mén)大力扶植云南咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，2014年星巴克正式入駐昆明，也促進(jìn)了咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。在咖啡制作過(guò)程中，咖啡果皮一般作為廢棄物被丟棄[7]，不但造成了資源的浪費(fèi)，也對(duì)環(huán)境造成了污染。研究表明，咖啡果皮粗提物中含有花色苷，具有較好的抗氧化活性[8]。目前，對(duì)咖啡果皮提取物的報(bào)道還不多，因此針對(duì)咖啡果皮提取工藝研究具有一定的必要性。

試驗(yàn)對(duì)云南小粒種咖啡果皮采用有機(jī)溶劑浸提的方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)法分析提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)等因素對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物提取效果的影響，并采用響應(yīng)曲面分析得到最佳的提取條件，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用咖啡果皮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南小粒種咖啡，購(gòu)于云南省普洱市北歸咖啡有限公司；甲醇，西隴化工股份有限公司提供；乙醇，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；鹽酸，重慶川東化工集團(tuán)有限公司提供。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；TSX-200型超聲波清洗機(jī)，天實(shí)中美（北京）科技有限公司產(chǎn)品；FD-1D-50型真空冷凍干燥機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司產(chǎn)品；T6型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝

挑選新鮮的咖啡果，通過(guò)剝皮得到咖啡果皮，在真空冷凍的條件下進(jìn)行干燥；利用粉碎機(jī)粉碎得到咖啡果皮粉，通過(guò)提取劑的浸提，離心后過(guò)濾；取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液；在真空冷凍的條件下干燥，得到咖啡果皮粗提物。

1.3.2 提取劑和最佳波長(zhǎng)的選擇

選擇pH值分別為2，3，4，5的HCl-甲醇和HCl-乙醇溶液為提取劑，稱取1 g咖啡果皮干粉；采用料液比1∶50于室溫下超聲波浸提1 h的方法，對(duì)其以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min；取上清液，確定最佳提取劑及最佳吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)已確定的最佳提取劑，稱取1 g咖啡果皮濃縮干粉，加入提取液，超聲波浸提一定時(shí)間，對(duì)其以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min。取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在最佳波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，觀察在不同條件下對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物提取的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間、提取溫度、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比4個(gè)參數(shù)為自變量（分別以X1，X2，X3，X4表示），按方程Xi=（Xi'-X0）/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼。式中，Xi為變量的編碼值；Xi'為變量的真實(shí)值；X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值；ΔX為變量的變化步長(zhǎng)。以吸光度為響應(yīng)值，每個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼；設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)提取工藝，并針對(duì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

響應(yīng)曲面法分析因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面法分析因素及水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑和最佳波長(zhǎng)的選擇

咖啡果皮粗提物在不同提取劑中的吸光度見(jiàn)圖1。

圖1 咖啡果皮粗提物在不同提取劑中的吸光度

由圖1可知，咖啡果皮粗提物在HCl-甲醇中溶解度好于在HCl-乙醇中的溶解度，其中在pH值為5時(shí)的HCl-甲醇中溶解度最好。

咖啡果皮粗提物紫外-可見(jiàn)光吸收光譜見(jiàn)圖2。

圖2 咖啡果皮粗提物紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

根據(jù)圖2紫外-可見(jiàn)光170～700 nm的掃描結(jié)果可知，咖啡果皮粗提物的最大吸收波長(zhǎng)為534 nm。這與王艷龍測(cè)定的矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品紫外可見(jiàn)光譜掃描得到的最佳吸收波長(zhǎng)相接近，經(jīng)后期試驗(yàn)驗(yàn)證可知咖啡果皮粗提物含有矢車菊素類物質(zhì)[8]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取劑對(duì)提取效果的影響

選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，40%，60%，80%，100%的甲醇（pH值為5）作為提取劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，于波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)吸光度達(dá)到最大。因此，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的甲醇（pH值為5）作為咖啡果皮提取劑。

2.2.2 料液比對(duì)提取效果的影響

選擇料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，于波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，吸光度隨料液比的增加而呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，料液比1∶20之后下降幅度減緩。綜合考慮成本和實(shí)際情況等因素，確定料液比為1∶20。

2.2.3 提取溫度對(duì)提取效果的影響

選擇提取溫度20，30，40，50，60℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，于波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，隨著提取溫度的升高，吸光度呈逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為40℃時(shí)吸光度最大，提取效果最好。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

選擇提取時(shí)間30，60，90，120，150 min進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，提取溫度40℃，于波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度增大，在120 min和150 min時(shí)相差不大，綜合考慮選擇提取時(shí)間為120 min。

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

選擇提取次數(shù)1，2，3次進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以80%的甲醇（pH值為5）作為提取劑，料液比1∶20，提取溫度40℃，提取時(shí)間120 min，于波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，吸光度隨提取次數(shù)的增加而呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，第1次提取時(shí)的吸光度最大，說(shuō)明1次已經(jīng)基本提取完全，因此提取次數(shù)為1次。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定提取次數(shù)為1次，以吸光度為響應(yīng)值，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0建立四因素三水平的Box-Behnken模型設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，共29組試驗(yàn)。

響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Exper 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到云南小粒種咖啡果皮粗提物對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

由表3方差分析可知，模型p≤0.000 1＜0.01表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.165 2＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著；R2=0.903 8，說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表3可知，模型一次項(xiàng)X1，X2不顯著，X3顯著，X4極顯著；二次項(xiàng)都是極顯著；交互項(xiàng)都不顯著，說(shuō)明不同的提取工藝與云南小粒種咖啡果皮粗提物的吸光度不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.3.3 響應(yīng)曲面交互作用分析

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)表3回歸分析的結(jié)果，做出模型的響應(yīng)曲面圖。

圖3 提取時(shí)間、提取溫度、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比兩兩因素之間對(duì)吸光度影響的響應(yīng)曲面

提取時(shí)間、提取溫度、提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比兩兩因素之間對(duì)吸光度影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖3。

圖3中直觀的反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，圓形表示2個(gè)因素之間的交互作用不顯著，而橢圓形表示2個(gè)因素之間的交互作用顯著。

由圖3（a）可知，隨著提取時(shí)間和提取溫度的增加，吸光度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比為最佳值時(shí)，提取時(shí)間和提取溫度在120 min，40℃時(shí)可得到吸光度的最大值。圖3（b）表明，隨著提取時(shí)間和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，吸光度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度和料液比為最佳值時(shí)，提取時(shí)間和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為120 min，76%～84%時(shí)可得到吸光度的最大值。圖3（c）顯示，在最優(yōu)提取溫度和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，提取時(shí)間和料液比對(duì)咖啡果皮粗提物吸光度的響應(yīng)結(jié)果。當(dāng)提取溫度和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最佳值時(shí)，提取時(shí)間和料液比分別為120 min，1∶20時(shí)可得到吸光度的最大值。圖3（d）表明，隨著提取溫度和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，吸光度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間和料液比為最佳值時(shí)，提取溫度和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為40℃，76%～84%時(shí)可得到吸光度的最大值。圖3（e）表明，在最優(yōu)提取時(shí)間與提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，提取溫度和料液比對(duì)咖啡果皮粗提物吸光度的響應(yīng)結(jié)果。當(dāng)提取時(shí)間和提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最佳值時(shí)，提取溫度與料液比分別為40℃，1∶20時(shí)可得到吸光度的最大值。圖3（f）表明，在最優(yōu)提取時(shí)間和提取溫度條件下，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)咖啡果皮粗提物吸光度的響應(yīng)結(jié)果。當(dāng)提取時(shí)間和提取溫度為最佳值時(shí)，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)與料液比分別為76%～84%，1∶20時(shí)可得到吸光度的最大值。

2.3.4 云南小粒種咖啡果皮最佳提取工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Box-Benhnken得到此回歸模型的最優(yōu)結(jié)果為提取時(shí)間116.34 min，提取溫度39.62℃，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)75.41%，料液比1∶17，在此條件下咖啡果皮粗提物的吸光度預(yù)測(cè)值為1.451。根據(jù)實(shí)際操作的可行性，將最佳工藝條件定為提取時(shí)間120 min，提取溫度40℃，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得的吸光度為1.432，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差較小，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可信。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定不同pH值的HCl-甲醇和HCl-乙醇溶液于400～700 nm波長(zhǎng)之間的吸光度，確定最佳的提取劑為pH值5的HCl-甲醇溶液；測(cè)定不同波段的波長(zhǎng)，確定最佳的波長(zhǎng)為534 nm。

通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察了提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)等因素的不同水平對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物提取效果的影響，選出對(duì)咖啡果皮粗提物提取效果有較大影響的因素及其大致范圍。然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比為主要考察因素，以測(cè)得的吸光度為主要考察指標(biāo)，利用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平方案和Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到最佳工藝參數(shù)為提取時(shí)間120 min，提取溫度40℃，提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20。利用響應(yīng)曲面分析法對(duì)云南小粒種咖啡果皮粗提物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，能較好地進(jìn)行提取，為云南小粒種咖啡副產(chǎn)物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

[1]黃家雄，李貴平.中國(guó)咖啡遺傳育種研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（4）：1 178-1 181.

[2]劉春華，李春麗，徐志.咖啡種類及其病蟲(chóng)害研究[J].中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，2010（5）：59-61.

[3]黃家雄，李貴平，楊世貴.咖啡種類及優(yōu)良品種簡(jiǎn)介[J].農(nóng)村實(shí)用技術(shù)，2009（1）：42-43.

[4]周華，李文偉，張洪波，等.咖啡種質(zhì)資源的引進(jìn)、研究及利用[J].云南熱作科技，2002，25（2）：1-6.

[5]李曉霞，張吉光，楊天武，等.云南不同海拔小粒種咖啡生長(zhǎng)及發(fā)育情況調(diào)查[J].云南熱作科技，2002，25（4）：8-16.

[6]楊瑞娟.云南小粒種咖啡發(fā)展現(xiàn)狀與展望[J].農(nóng)業(yè)實(shí)用技術(shù)，2012（10）：15-16.

[7]何紅艷，文志華，李國(guó)鵬.咖啡采后處理及初加工技術(shù)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（12）：119-120.

[8]張?jiān)弃Q，付曉萍，梁文娟，等.云南小粒種咖啡果皮粗提物花青素成分及抗氧化活性研究[J].食品科技，2016，41（5）：219-222.◇

Optimization of the Extraction Technology of Crude Extracts from Yunnan Arabica Coffee Husk via Response Surface Methodology

ZHANG Yunhe，F(xiàn)U Xiaoping，LIN Qi，YANG Yan，HAN Zhonghui，YIN Xiong，*FAN Jiangping
（College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China）

Yunnan Arabica coffee husk extractant possessed anthocyanin，which has antioxidant activity.The extraction technology of the crude extracts of Yunnan Arabica coffee husk is studied by response surface methodology.On the basis of single factor test，selecting the extraction time and temperature，concentration and solid-liquid ratio as independent variables，the effect of these factors and their interaction on Yunnan Arabica coffee husk extracts are studied by response surface method. The regression equation of Yunnan Arabica coffee husk extracts extraction is simulated，as well as the optimum extraction conditions for the extraction process.The extraction process are determined：extraction time 120 min，extraction temperature 40℃，extractant concentration 80%，solid-liquid ratio 1∶20.The processing can be preferably extracted Yunnan Arabica coffee husk extractant as well as prepared for isolating anthocyanin.

Yunnan Arabica coffee；extraction processing；response surface methodology

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.009

1671-9646（2017）03a-0029-04

2017-02-08

云南省教育廳重大專項(xiàng)（ZD2014007）。

張?jiān)弃Q（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏及加工工程。

*通訊作者：范江平（1972—），男，博士，教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)教學(xué)和研究。