大通縣流產胎兒中病原菌的分離鑒定及系統發育樹分析

李穩欣，張學勇，徐 龍，郭志宏，馬利青

（青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016）

大通縣流產胎兒中病原菌的分離鑒定及系統發育樹分析

李穩欣，張學勇，徐 龍，郭志宏，馬利青

（青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016）

從送檢的流產胎兒病料中，分離培養得到2株致病菌，經生化試驗、藥物敏感性試驗和分子生物學鑒定，分離菌株為致病性大腸桿菌。體外藥物敏感性試驗顯示，該菌對紅霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；對桿菌肽中度敏感；對青霉素、四環素、阿莫西林等耐藥。說明此次引起該豬場流產的主要原因為致病性大腸桿菌感染。

仔豬；分離；鑒定；大腸桿菌

大腸埃希氏菌（Escherichia coil,E.coil）常稱為大腸桿菌，屬革蘭氏陰性短桿菌，研究初期認為該菌為腸道正常菌群，隨著研究的深入，該菌被證實對人和動物有一定的致病性，尤其嬰兒和幼畜最易感染，常引起腹瀉和敗血癥，每年由該菌引起疾病的發病率和病死率很高，嚴重威脅人類和養殖業健康有序發展[1]。

2016年12月，青海省大通縣某養殖豬場母豬出現流產現象，母豬產死胎、弱胎。多數新生仔豬消瘦，弓背，被毛雜亂，腹瀉，排出白色或灰白色粥樣糞便，并伴有腥臭味。隨后將流產胎兒送檢至青海省畜牧獸醫科學院生物技術研究室要求確診病因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自青海省西寧市大通縣某豬場流產胎兒3份。命名1號、2號和3號病料。

1.1.2 主要培養基及儀器設備 普通營養肉湯購自于北京索萊寶科技有限公司；普通營養瓊脂平板、鮮血平板培養基和厭氣肉肝湯，自制；麥康凱、伊紅美藍、三糖鐵和MH培養基購自于青島高科園海博生物技術有限公司；藥敏片購自于Oxoid公司；DNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司；PCR儀購自于杭州晶格科學儀器有限公司；PCR所用試劑及預混酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗動物 昆明系小鼠6只，雌雄各半，6～8周，體重15～18g，購自青海省地方病研究所試驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養 將流產胎兒的心臟、肝臟、脾臟、臟肺、腎臟和胃內容物等病料分別接種至普通營養肉湯、鮮血平板和厭氣肉肝湯中，37℃恒溫培養24 h，觀察菌落形態及培養特性。挑選具有溶血現象的單個菌落，分別接種到普通營養肉湯和鮮血平板，37℃純化培養24 h，觀察菌株在各個培養基上的生長情況，并將培養物涂片、染色鏡檢，觀察培養物的形態學特征和一致性。

1.2.2 生化特性鑒定 對分離菌株進行氨基酸生化管（鳥氨酸、賴氨酸）、山梨醇、尿素、硫化氫、糖微量發酵管（棉子糖、葡萄糖、木糖）、蛋白胨水、半固體瓊脂、側金盞花醇、葡磷胨水和枸櫞酸鹽管等試驗。37℃，培養24 h，觀察并記錄結果。

1.2.3 動物致病性試驗 將有溶血現象，且純化的菌株，接種至普通營養肉湯培養18 h后，經腹腔，注射給2只試驗小鼠，劑量為0.2 mL/只，另取2只小鼠做陰性對照，每只腹腔注射0.2 mL普通營養肉湯；統一飼養，觀察記錄試驗小鼠的精神狀態、飲食及存活等情況。對死亡小鼠進行剖解，無菌采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織接種至鮮血平板培養基，37℃，培養24 h，對溶血菌落進行染色鏡檢。觀察生長特性、形態特征與接種菌株的一致性。

1.2.4 PCR鑒定 提取分離菌株基因組DNA，用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；60℃退火45 s；72℃延伸2 min 10 s，循環35次，最后72℃ 10 min。擴增后的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后收集條帶，送往測序公司進行測序。引物信息及PCR擴增優化體系詳見表1和表2。

表1 引物及序列

表2 PCR反應體系

1.2.5 系統發育分析 通過測序獲得序列信息，利用DNA star軟件拼接序列后，利用在線“BLAST”工具，對序列進行同源性比對，并運用MEGA 5.0軟件自展1 000次構建系統發育樹。

1.2.6 藥敏試驗 參照我國衛生行業最新標準和美國臨床和實驗室標準化協會標準CLSL M100，采用K-B紙片擴散法，將菌懸液均勻涂布于MH培養基上，用無菌鑷子放置4～5片抗生素藥敏片，37℃，孵育24 h，測定抑菌圈直徑，根據有無抑菌圈及抑菌圈直徑大小判斷分離菌對各種藥物的敏感程度。

2 結果與分析

2.1 培養特性及鏡檢結果

3份流產胎兒的胃內容物接種至普通營養肉湯、鮮血平板和厭氣肉肝湯中，經37℃恒溫培養24 h，普通營養肉湯和厭氣肉肝湯均勻混濁；接種鮮血平板上的1號和2號病料胃內容物的有灰白色、光滑、邊緣整齊并隆起的大菌落，呈明顯β溶血，3號病料沒有溶血菌落。2株分離菌株接種三糖鐵培養基上，培養后底部均變黑，表明產生硫化氫；伊紅美藍培養基上為金屬色菌落，中等大小；麥康凱培養基上為枚紅色菌落，經革蘭氏染色鏡檢均為革蘭氏陰性短桿菌，鏡檢結果詳見圖1。

圖1 革蘭氏陰性短桿菌（100×）

2.2 分離株的生化特性

2株分離菌株均能分解葡萄糖產氣；發酵棉子糖、木糖和乳糖；分解山梨醇、鳥氨酸和賴氨酸。具體生化特性見表3。

表3 2株分離菌株的生化特性

2.3 動物致死試驗結果

將培養24 h的培養物注射給2只試驗組小鼠后，2只試驗組小鼠均在24 h內死亡。對照組小鼠生長發育正常。解剖死亡小鼠，發現肝臟稍腫大，脾臟腫大，肺臟邊緣出血，腸壁變薄內含黃色黏性物質。從死亡小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中分離培養細菌，其生長特性、形態特征與接種菌株一致。

2.4 PCR鑒定結果

以分離菌株基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增，結果顯示2株分離菌株均在1 486 bp左右處有清晰條帶，與預期條帶大小相符，詳見圖2。

圖2 分離菌株16S rRNA擴增結果

2.5 序列比對及系統發育樹分析

陽性樣品測序自編號為D1F2017，與GenBank中已發表大腸桿菌序列進行比對，系統發育樹分析顯示D1F2017與印度蝙蝠糞樣品中分離出的大腸桿菌（登錄號為KT260462）的親緣關系較近，同源性達99%，詳見圖3。

圖3 分離菌株系統發育樹

2.6 藥敏試驗結果

為進一步了解豬源中大腸桿菌的耐藥譜，篩選出高敏藥物，為獸醫臨床用藥提供理論參考，減少抗生素濫用。藥敏試驗結果表明：分離菌對紅霉素、多黏菌素B和多黏菌素E敏感；對桿菌肽中度敏感；對青霉素、四環素、阿莫西林等耐藥，詳見表4。

表4 分離株的藥敏試驗結果

3 小結與討論

從送檢的流產胎兒病料中，分離培養得到2株致病菌，經生化試驗、藥物敏感性試驗和分子生物學檢測，鑒定分離菌株為致病性大腸桿菌。根據藥物敏感性圖譜，建議使用紅霉素敏感藥物對母畜進行臨床治療，經治療后，很快控制了疫情。

同時，我們對送檢樣品進行了偽狂犬病病毒、圓環病毒2型、藍耳病病毒和豬瘟病毒核酸的檢測，均未檢出可疑條帶。

應該對耐藥菌株引起重視，這可能與飼養過程中長期添加抗菌藥物有關。這些耐藥菌株可垂直傳播和水平傳播，對人類和公共衛生學安全構成潛在的威脅[3-4]。因此，合理使用抗菌藥物，掌握本地區菌株的抗藥譜是十分有必要的[5-9]。

從系統發生樹可以看出，本次分離的菌株和印度文獻發表的從蝙蝠糞中分出的大腸桿菌的同源性相近（99%）。因此，保持圈舍環境衛生，防止圈養家畜和外界野生動物接觸，減少病原菌的相互傳播。同時，加強對產前母豬的飼養管理，給母豬提供充足的營養，提高仔豬出生的免疫力。保證產房清潔干燥，注意消毒。分娩舍、保育舍遵守“全進全出”和“空欄消毒、間歇一周”的原則。吃足初乳和生態制劑，保證新生仔豬的營養平衡[10]。

[1] 展天松，王彥紅，許夢怡，等.腸致病性大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（2）：67-69.

[2] 任梅滲，王印，楊澤曉，等.豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與生物學分析[J].中國人獸共患病學報，2015，31（12）：1093-1097.

[3]劉艷紅，李穎，呂淑霞.沙門氏菌和大腸桿菌耐藥性的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2016（10）：88-90.

[4]湯景元，王紅寧，張鵬舉，等.95個豬場大腸桿菌耐藥表型及氨基糖苷類藥物耐藥基因型調查[J].畜牧獸醫學報，2008，39（4）：472-477.

[5]Lu L M,Lei D,Yang W,et al.Characterization of antimicrobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China[J].Acta Tropica,2010,113(1):20.

[6]Lanz R,Kuhnert P,Boerlin P.Antimicrobial resistance and resistance gene determinants in clinical Escherichia coli from different animal species in Switzerland[J].Veterinary Microbiology,2003,91(1):73-84.

[7] 貢嘎，王剛，拉珍，等.西藏牦牛大腸桿菌對常用抗菌藥物的耐藥性分析[J].中國獸醫雜志，2014，50（8）：80-82.

[8] 陳朝喜，張郁，西格基.患病牦牛源大腸桿菌對10種不同抗菌藥物敏感性試驗 [J].西南民族大學學報（自然科學版），2014，40（1）：20-23.

[9] 魯志平，曾群輝.西藏牦牛大腸埃希氏菌生物學特性的研究[J].西藏科技，2009（11）：27-30.

[10]余建榮，程傳福，馬圣利.仔豬大腸桿菌病的診斷與防治[J].現代農業科技，2016（12）：275.

（編輯：郭玉翠）

Isolation,Identification and Phylogenetic Analysis of Pathogen from Piglets Samples of Datong County

LI Wenxin,ZHANG Xueyong,XU Long,GUO Zhihong,MA Liqing
(Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China)

Two pathogenic bacterias were isolated from clinical died abortion piglets samples.The result showed that the isolated strains were Escherichia coli strains,which were identified by biochemical tests,drug sensitivity tests and molecular methods.Drug sensitivity experiment showed that the separated strains were sensitive to Erythromycin,Polyadherin B and Polyadherin E.Moderate sensitivity to Bacitracin.Drug resistance to Penicillin, Tetracycline and Amoxicillin.The study showed that the Escherichia coli strains were the main pathogeny which causes the sow abortion.

piglets;isolation;identification;Escherichia coli

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0097-03

2017-02-14

國家農業產業技術體系（CARS-40-4B）

李穩欣（1989-），女，河南開封人，在讀碩士研究生，研究方向為預防獸醫學.E-mail：1531395936@qq.com

馬利青（1967-），男，研究員，主要從事動物疾病的診斷和防治研究工作.E-mail：maliq67@hotmail.com