CK5/6、EGFR、p53與Ki67在乳腺癌組織中的表達及其意義

楊宇峰，李鑌薇，林思園，張利華，楊梅

（東莞市第三人民醫院病理科1、乳腺科2，廣東東莞523326）

CK5/6、EGFR、p53與Ki67在乳腺癌組織中的表達及其意義

楊宇峰1，李鑌薇1，林思園2，張利華2，楊梅2

（東莞市第三人民醫院病理科1、乳腺科2，廣東東莞523326）

目的檢測表皮生長因子受體(EGFR)、細胞角蛋白5/6(CK5/6)、p53蛋白(p53)和細胞增殖核抗原Ki67(Ki67)在乳腺癌中的表達及其表達的相關性，并探討其與乳腺癌患者的臨床和病理特征的關系。方法回顧性分析東莞市第三人民醫院2010年1月至2011年12月間108例經病理確診的乳腺癌患者的臨床及病理資料。免疫組化檢測EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達，Spearman相關分析蛋白表達的相關性，χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析蛋白表達與患者臨床及病理指標之間的關系。結果EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中陽性表達率分別為17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)；EGFR與CK5/6和p53呈正相關(r=0.282，r=0.241)，CK5/6與p53和Ki67呈正相關(r=0.217，r=0.190)，p53和Ki67呈正相關(r=0.193)，相關性均有統計學意義(P＜0.05)；EGFR、CK5/6、p53和Ki67在三陰乳腺癌組織中的表達比非三陰乳腺癌組織中的表達更高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；與CK5/6或EGFR陰性的乳腺癌患者比較，CK5/6或EGFR陽性的乳腺癌患者的中位復發時間相對較短，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論EGFR和CK5/6在乳腺癌組織中的高表達提示CK5/6和EGFR可以作為乳腺癌預后不良因素。

表皮生長因子受體；細胞角蛋白5/6；p53蛋白；細胞增殖核抗原Ki67；乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來，分子標記物在乳腺癌的診療及預后判斷中起著越來越重要的作用。EGFR屬于1型生長因子受體家族成員，乳腺癌患者EGFR的過表達預示其預后差。CK5/6屬于細胞角蛋白家族成員，是免疫組化診斷基底細胞樣型乳腺癌的一個重要標記物。p53是具有腫瘤抑制和轉錄活性的抑癌基因，其突變與乳腺癌的發生有一定的相關性。Ki67是一種與細胞增殖特異相關的核蛋白，可用來評價乳腺癌細胞增殖活性,且對判斷乳腺癌患者預后有重要意義。盡管已有不少研究評價這些標記物在乳腺癌中的表達，但是較少聯合檢測這些標記物在乳腺癌中的表達及其意義。本文主要通過免疫組化檢測EGFR、CK5/6、P53和Ki67在乳腺癌中的表達，分析它們表達的相關性，并探討其與乳腺癌患者的臨床和病理特征之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集東莞市第三人民醫院2010年1月至2011年12月間經病理確診的乳腺癌標本108例，所有組織樣本均行免疫組化檢測。乳腺癌的診斷、分級及分期標準參照2012版乳腺腫瘤WHO分類。108例患者中女性107例，男性1例；年齡32～75歲，平均54歲；腫瘤大小≤2 cm者54例，＞2 cm者54例；有淋巴結轉移者35例，無轉移者73例；組織學分級Ⅰ級7例，Ⅱ級48例，Ⅲ級53例；臨床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期55例，Ⅲ期21例，Ⅳ期1例。三陰性癌(即ER-、PR-及HER2-)22例，非三陰性癌86例，其中管腔A型(Luminal A型，即ER+和/或PR+、HER2-)62例、管腔B型(Luminal B型，即ER+和/或PR+、HER2+)11例、HER2陽性型(即ER-、PR-、HER2+)13例。

1.2 免疫組化檢測乳腺癌組織的石蠟標本連續切片，經脫蠟、微波修復抗原，孵育單克隆一抗及二抗，DAB顯色，蘇木素對比染色，觀察陽性染色的部位及強度。每批染色均設置陽性、陰性對照，已知陽性的乳腺癌組織切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。所有抗體包括：ER、PR、HER2、EGFR、CK5/6、p53及Ki67，均購于北京中杉公司。ER/PR陽性定義為在腫瘤細胞核中出現陽性著色且著色細胞≥1%，而ER/PR陰性為在腫瘤細胞核不著色或著色細胞＜1%[1]。HER2的免疫組化染色評價采用0～+++評分系統[2]。染色強度0和+為陰性，染色強度+++為陽性，而染色強度++的病例需進一步行FISH檢測確定有無HER2基因擴增。EGFR和CK5/6陽性為任何數量浸潤性癌細胞胞漿和或胞膜著色[3]。p53和Ki67陽性為腫瘤細胞核著色≥10%[4]。

1.3 HER2的FISH檢測HER2免疫組化染色強度++的病例進一步行FISH檢測確定有無HER2基因擴增。FISH檢測遵循試劑盒說明書的建議，試劑盒購于安必平公司。HER2基因擴增定義為HER2/CEP17比率超過2.0。總之，HER2陽性為免疫組化染色強度+++和或FISH檢測HER2基因擴增，而HER2陰性為免疫組化染色強度0/+和/或FISH檢測HER2基因無擴增。

1.4 統計學方法應用SPSS16.0統計軟件分析數據。蛋白表達與臨床病理資料之間的關系采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。蛋白間的關聯性分析采用Spearman相關分析。Kaplan-Meier法計算生存曲線并比較生存曲線間的差異。Cox比例風險回歸模型分析影響乳腺癌預后的獨立風險因素。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達免疫組化結果顯示EGFR表達定位于胞膜，CK5/6表達定位于胞漿，p53和Ki67表達定位于胞核(圖1)。EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達陽性率分別為17.6%(19/108)、25.9%(28/108)、42.6%(46/108)和51.9%(56/108)。

圖1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達

2.2 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中表達的相關性Spearman相關分析結果顯示：EGFR與CK5/6、p53呈正相關(r=0.282，r=0.241)，CK5/6與p53和Ki67呈正相關(r=0.217，r=0.190)；p53和Ki67呈正相關(r=0.193)，相關性均有統計學意義(P＜0.05)。其余蛋白間不存在表達相關性。

2.3 EGFR、CK5/6、p53和Ki67在乳腺癌組織中的表達與臨床病理特征的關系在108例乳腺癌中，EGFR、CK5/6和p53在三陰乳腺癌組織中的表達比非三陰乳腺癌組織中的表達更高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但是它們的表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、病理分級、組織學類型等臨床及病理指標之間均無統計學意義(P＞0.05)；Ki67在三陰性乳腺癌和組織學分級高組的表達率高于非三陰性乳腺癌和組織學分級低組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而其表達與其他臨床病理指標之間無明顯相關性，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.4 EGFR、CK5/6、p53和Ki67表達與乳腺癌復發的關系EGFR陽性的乳腺癌患者和陰性患者中位復發時間分別為38個月(18～77個月)及43個月(22～79個月)，EGFR陽性的乳腺癌患者比EGFR陰性的乳腺癌患者有相對較短的中位復發時間，差異具有統計學意義(P=0.002)。CK5/6陽性的乳腺癌患者和陰性患者中位復發時間分別為41個月(22～77個月)及46個月(18～79個月)與CK5/6陰性的乳腺癌患者比較，CK5/6陽性的乳腺癌患者的中位復發時間相對較短，差異具有統計學意義(P=0.017)(圖2)。p53和Ki67差異性表達與腫瘤中位復發時間無統計學相關性(P= 0755，P=0.069)。Cox多因素回歸分析顯示EGFR、CK5/6、p53和Ki67差異性表達不是影響乳腺癌復發的獨立因素。

表1 EGFR、CK5/6、p53和Ki67的表達與乳腺癌臨床病理參數的關系(例)

圖2 K-M法計算EGFR和CK5/6表達與乳腺癌復發之間的關系

3 討論

乳腺癌是一種異質性腫瘤，根據基因表達類型可將乳腺癌分為5個主要亞型：腺腔A型、腺腔B型、HER2過表達型、基底細胞樣型和正常乳腺樣型[5-6]。

各分子亞型的臨床特征、治療敏感性及預后均存在很大差異。由于乳腺癌基因分型對送檢標本要求高，需要新鮮組織，檢測價格昂貴，且實際操作困難，因此臨床上僅通過免疫組化半定量測定ER、PR和HER2等分子標記物的表達來判斷乳腺癌的類型，與準確的分子亞型略有不同。

目前臨床上常將乳腺癌分為三陰性癌和非三陰性癌，而三陰性癌具有侵襲性強、局部復發率高和遠處轉移早、預后差的特點。目前在臨床上對該類患者尚無特異性的靶向治療方法，內分泌治療及化療效果也不明顯。三陰性乳腺癌中85%與基底細胞樣型在免疫表型特征上相關[4]，此外還包含了部分正常乳腺樣型。Nielsen等[7]認為ER、PR及HER2均陰性，且CK5/6和(或)EGFR陽性者被稱為基底細胞樣乳腺癌。依據上述定義，我們研究隊列中基底細胞樣乳腺癌占比為15.7%(17/108)，接近Nielsen等[7]報道的結果。

細胞角蛋白CK5/6是乳腺基底細胞產生并表達的產物，屬于CK家族成員之一。本研究顯示在三陰性乳腺癌中CK5/6陽性表達率為59.1%(13/22)，而非三陰性癌中其陽性表達率為17.4%(15/86)，CK5/6在三陰性及非三陰性癌中表達差異有統計學意義(P＜0.05)，提示三陰性乳腺癌是一類具有特殊起源的乳腺癌，有可能起源于乳腺組織的基底層中。

EGFR屬于I型生長因子受體家族成員。EGFR過度表達可促使乳腺腫瘤細胞增殖、血管生成，進而促進細胞轉移、抑制細胞凋亡[8]。本研究顯示在三陰性乳腺癌中EGFR陽性表達率為45.5%(10/22)，而非三陰性癌中其陽性表達率為10.5%(9/86)，EGFR在三陰性及非三陰性癌中表達差異有統計學意義(P＜0.05)，提示EGFR過表達在三陰性乳腺癌的發生發展中可能起重要作用。

Cheang等[3]回顧性分析了3 744例浸潤性乳腺癌，發現以三陰性乳腺癌標準定義的基底細胞樣型乳腺癌占所有乳腺癌的17%，而以ER、PR、HER2陰性再加上CK5/6和EGFR五項指標來定義的基底細胞型乳腺癌僅占9%，并且發現五項指標定義的基底細胞樣型乳腺癌的預后比三陰性乳腺癌差，此結果提示CK5/6和EGFR陽性乳腺癌患者預后不良。我們的研究發現CK5/6或EGFR陽性的乳腺癌患者中位復發時間相對較短，支持CK5/6和EGFR陽性預示乳腺癌患者預后不良。此外，CK5/6與EGRF之間存在共表達性，提示兩者在乳腺癌的不良預后中可能發揮協同作用。

p53是常見的抑癌基因，野生型具有抑癌功能，而突變型與人類腫瘤的發生密切相關。本組研究顯示p53在乳腺癌中陽性表達率為42.6%，與Cianga等[9]報道的p53陽性率結果相近。筆者發現p53在三陰性乳腺癌中表達陽性率(72.7%)明顯高于在非三陰性乳腺癌的陽性率(34.9%)。但并未發現p53的差異性表達與年齡、組織學類型、腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級、臨床分期等重要臨床病理參數相關，可能與本研究樣本數量較少有關，在以后的研究工作中將增加樣本數量繼續探討。

Ki67是一種與細胞增殖特異性相關的核抗原，主要用于判斷細胞增殖活性，通常在乳腺癌的預后及治療方面起指導作用[10]。本研究顯示Ki67在三陰性乳腺癌中陽性率(72.7%)明顯高于在非三陰性乳腺癌中陽性率(46.5%)，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明Ki67的高表達預示乳腺癌患者不良預后。

總之，除了檢測ER、PR和HER2的表達狀態外，通過免疫組化聯合檢測CK5/6、EGFR、p53和Ki67等分子標記物有助于綜合評價乳腺癌生物學行為及預后判定，為臨床選擇治療方案及個體化治療提供依據。

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[2]Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(1):18-43.

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[4]張朝林,李宏,李金平.p53、Ki67、EGFR、Nm23在乳腺癌組織中的表達及臨床意義[J].海南醫學,2014,25(1):15-17.

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Expression of CK5/6,EGFR,p53 and Ki67 in breast cancer and their significance.

YANG Yu-feng1,LI Bin-wei1, LIN Si-yuan2,ZHANG Li-hua2,YANG Mei2.Department of Pathology1,Department of Breast Surgery2,Dongguan Third People's Hospital,Dongguan 523326,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of cktokeratin5/6(CK5/6),epidermal expression of growth factor receptor(EGFR),p53 and nuclcar-associated antigen Ki67(Ki67)in breast cancer,and investigate the association of their expression with clinical and pathological features in breast cancer.MethodsWe performed a retrospective analysis of 108 breast cancer patients from Dongguan Third People's Hospital between January 2010 and December 2011.Expression of EGFR,CK5/6,p53 and ki67 were detected in breast cancer tissues by immunohistochemical methods,and their expression correlation was analyzed by Spearman analysis.Chi-square or Fisher's exact test was used to investigate their relationships with clinical and pathological indexes.ResultsOut of the 108 cases,the positive rates for EGFR, CK5/6,p53 and Ki67 were 17.6%(19/108),25.9%(28/108),42.6%(46/108)and 51.9%(56/108),respectively.Correlation analysis indicated positive correlation between EGFR and CK5/6,p53(r=0.282,r=0.241),positive correlation of CK5/6 with p53 and Ki67(r=0.217,r=0.190),and positive correlation between p53 and Ki67(r=0.193)(P＜0.05 for all). Expression of EGFR,CK5/6,p53和Ki67 were found significantly up-regulated in triple negative breast cancer compared to non-triple negative breast cancer(P＜0.05 for all).Median time to relapse was shorter for the patients with CK5/ 6 or EGFR-positive tumors compared to the ones with CK5/6 or EGFR-negative cases(P＜0.05).ConclusionThe up-regulated expression of EGFR and CK5/6 in breast cancer may be correlated with a worse prognosis.

Growth factor receptor(EGFR);Cktokeratin5/6(CK5/6);p53;Ki67;Breast cancer

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.009

R737.9

A

1003—6350（2017）08—1233—04

2016-10-27)

廣東省東莞市科技計劃醫療衛生類科研一般項目（編號：20131051010064）

楊宇峰。E-mail：y313yang260@163.com