吉西他濱與奧曲肽聯合應用對前列腺癌細胞PC-3的抑制作用

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(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院泌尿外科，上海200025；2.上海健康醫學院附屬周浦醫院泌尿外科，上海201318)

吉西他濱與奧曲肽聯合應用對前列腺癌細胞PC-3的抑制作用

郝繼東1,2，孫?？?

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院泌尿外科，上海200025；2.上海健康醫學院附屬周浦醫院泌尿外科，上海201318)

目的研究吉西他濱與奧曲肽聯合用藥對去勢抵抗性前列腺癌細胞PC-3增殖的抑制作用及對凋亡的影響。方法體外培養人前列腺癌細胞株PC-3，應用MTT細胞實驗研究空白組、對照組、不同濃度的奧曲肽組(0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL)與吉西他濱組(1μg/mL)單獨使用以及聯合使用不同時間段對PC-3細胞增殖抑制的影響；應用流式細胞儀檢測對照組、奧曲肽組(8μg/mL)與吉西他濱組(1μg/mL)單獨使用及聯合使用對PC-3細胞凋亡的影響；并用Western-blot實驗研究對照組、奧曲肽組(8μg/mL)與吉西他濱(1μg/mL)單獨使用及聯合使用對凋亡指標Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase9表達的影響。結果MTT細胞實驗顯示，聯合用藥組作用72 h后，抑制率可達62%，顯著高于對照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有顯著統計學意義(P＜0.05)；AnnexinV-FITC細胞凋亡實驗結果表明，聯合用藥組凋亡率25%，顯著高于對照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有顯著統計學意義(P＜0.05)；Western-blot結果顯示，聯合用藥組Bcl-2表達低于對照組、奧曲肽組和吉西他濱組，而其Bax，Caspase3、Caspase9蛋白表達量顯著高于對照組、奧曲肽組和吉西他濱組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論吉西他濱和奧曲肽可以協同作用，增強對去勢抵抗性前列腺癌細胞系PC-3的增殖抑制和促凋亡作用，提示臨床上兩者聯合應用于去勢抵抗性前列腺癌治療的可行性。

吉西他濱；奧曲肽；前列腺癌；增殖；凋亡

奧曲肽是一種八肽生長抑素類似物，在臨床上廣泛應用于急性重癥出血癥和胰腺炎的治療。近年來，隨著對生長抑素在抗腫瘤方面機制的進一步研究，奧曲肽在腫瘤治療方面的研究也逐漸增多。Teunissen等[1]應用奧曲肽治療Hurthle細胞甲狀腺癌，腫瘤體積明顯縮小。Bodei等[2]對21例甲狀腺髓樣癌應用奧曲肽治療2～8周后，67%的患者得到治愈或緩解。Schmitt等[3]報道，注射奧曲肽治療一周后，鼠荷小細胞肺癌模型的腫瘤明顯縮小。吉西他濱是一種二氟核苷類抗代謝物抗癌藥，臨床應用于治療非小細胞肺癌及胰腺癌等。吉西他濱與奧曲肽聯合用藥在多種癌癥中都有很好療效，但對于前列腺癌的作用卻沒有報道。本研究選擇人去勢抵抗性前列腺癌細胞系PC-3為研究對象，探究吉西他濱和奧曲肽聯合用藥及單獨用藥對PC-3細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑人去勢抵抗性前列腺癌細胞系PC-3購自中國科學院生物化學所。DMEM培養基、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司。PMSF購自Amresco公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MTT試劑盒購自碧云天生物有限公司。DMSO、青霉素、鏈霉素購自Sigma公司。吉西他濱購自江蘇豪森藥業公司，奧曲肽購自上海第一生化藥業有限公司。Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9抗體購自Santa Cruze公司。

1.2 PC-3細胞培養PC-3細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)中，37℃，5%CO2條件下擴增。細胞增殖到接觸抑制，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。細胞用藥分為空白對照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯合用藥組。

1.3 MTT細胞實驗將PC-3細胞培養于含10% FBS的DMEM培養液中，待細胞長滿培養瓶90%時用胰酶消化后血球計數板計數，調整細胞懸液濃度，每孔加入細胞培養液定容至100μL，96孔板每孔5 000個細胞，設3個復孔。每3 d換液一次。置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養24 h。將奧曲肽，0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL，及吉西他濱1μg/mL及吉西他濱1μg/mL加奧曲肽各濃度組按照事先約定的濃度加入至相應孔中，同時設置空白組(沒有PC-3細胞，只加入相同量的培養基和MTT及DMSO)、對照組(PC-3細胞、相同濃度的藥物溶解介質、細胞培養液、MTT和DMSO)，每組設五個復孔。分別培養24 h、48 h和72 h后小心吸去上清，加入80 μL新鮮培養液，再加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，并繼續培養4 h。然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值。計算抑制率%=[(對照-空白)-(給藥-空白)]/(對照-空白)×100%

1.4 AnnexinV-FITC細胞凋亡實驗細胞分組為：對照組(正常培養的PC-3細胞)、奧曲肽組(8.0μg/mL)、吉西他濱組(1μg/mL)和聯合用藥組(奧曲肽8μg/mL+吉西他濱1μg/mL)作用細胞72 h。收集細胞，PBS重懸細胞并計數。取5～10萬細胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入195 μLAnnexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入5 μLAnnexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.5 Western-blot實驗各組作用細胞72 h用含PMSF裂解液裂解細胞，10 000 g離心10 min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白上樣量定于20 μg與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，離心。上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳。400 mA轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉過夜，一抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min，二抗孵育1 h，TTBS清洗3次，每次10 min。ECL發光，顯影。

1.6 統計學方法應用SPSS16.0統計學軟件包統計，計量資料以均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 奧曲肽、吉西他濱及聯合用藥對PC-3細胞增殖的作用由圖1結果可見，MTT細胞實驗顯示，奧曲肽對PC-3細胞的抑制率與濃度和作用時間呈正相關，隨濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸增加，在8 μg/mL濃度下作用72 h，抑制率可達到46%。1 μg/mL吉西他濱單獨作用抑制率可達到26%，而聯合用藥在每個時間點相對于單獨用藥，抑制率都有明顯的上升，聯合用藥作用72 h后，抑制率可達到62%。

圖1 奧曲肽、吉西他濱及聯合用藥對PC-3細胞增殖的抑制率

2.2 AnnexinV-FITC細胞凋亡實驗由圖2及圖3結果可見，對照組凋亡率顯著低于其他各處理組，聯合用藥組凋亡率顯著高于對照組，吉西他濱組凋亡率顯著高于其他各處理組，但低于聯合用藥組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 Western-blot檢測凋亡相關蛋白表達由圖4和圖5可見，對照組Bcl-2蛋白表達量顯著高于其他組，聯合用藥組的Bcl-2，蛋白表達量顯著低于其他組，對照組Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達量顯著低于其他組，聯合用藥組的Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達量顯著高于其他組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 對照組、奧曲肽組、吉西他濱組及聯合用藥組PC-3細胞凋亡的流式細胞圖

圖3 對照組、奧曲肽組、吉西他濱組及聯合用藥組對PC-3細胞凋亡的影響

圖4 對照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯合用藥組Western-Bolt實驗結果

圖5 對照組、奧曲肽組、吉西他濱組和聯合用藥組對PC-3細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

前列腺癌在當前世界上位居發達國家男性腫瘤發病率的首位，在我國，其發病趨勢也是不斷上升[4-6]。常規化療藥物對去勢抵抗性前列腺癌效果不佳，因此，尋求更佳的化療藥物一直是前列腺癌治療的研究熱點。

奧曲肽是人工合成的8個氨基酸的生長抑素類似物，可以作用于腫瘤細胞，使細胞周期停滯在G0/G1期，抑制腫瘤細胞增殖，并促進細胞凋亡。吉西他濱是脫氧胞苷的類似物，可以抑制核糖核苷酸還原酶的活性，從而阻斷腫瘤細胞DNA復制，抑制細胞增殖。前列腺癌治療涉及多個方面，單從一個角度治療效果不佳，因此，目前臨床上多采用多種藥物聯合治療。奧曲肽和吉西他濱聯合用藥對胰腺癌、非小細胞肺癌都有不錯的效果，因此本文對兩者聯合用藥對前列腺癌細胞株PC-3的作用做了研究。

本研究MTT細胞實驗顯示，奧曲肽對PC-3細胞的抑制增殖作用隨時間增長和藥物濃度增加而逐步提高，但抑制率始終徘徊在50%以下，而吉西他濱單獨用藥，只可達到22%左右的抑制率，兩者單獨作用效果不佳。奧曲肽各個濃度與吉西他濱聯合使用后抑制率普遍高于單獨使用，并在72 h，8 μg/mL的藥物濃度作用下，使抑制率達到60%以上。流式細胞術檢測凋亡的結果反映了兩種藥物對PC-3細胞凋亡的影響，單獨用藥，奧曲肽和吉西他濱只能促使PC-3細胞凋亡比率為10%～15%，凋亡細胞數目不多，而聯合用藥72 h后凋亡細胞的比率顯著上升，達到接近30%的水平。為了進一步證明對細胞凋亡的影響，我們檢測了細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9的表達。從結果來看，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達在聯合用藥作用下抑制明顯，而Bax促凋亡基因的表達顯著升高。細胞發生凋亡程序后，Caspase3、Caspase9表達上升，促使細胞進行凋亡程序。

從以上結果可以看出，奧曲肽和吉西他濱聯合用藥，對于PC-3前列腺癌細胞株具有顯著的抑制作用，并促使PC-3細胞凋亡，這對臨床進行聯合用藥治療前列腺癌具有重要的指導作用。

[1]Teunissen JJ,Kwekkeboom DJ,Kooij PP,et al.Peptide receptor radionuclide therapy for non-radioiodine-avid differentiated thyroid cancer[J].J Nucl Med,2005,46:107-114.

[2]Bodei L,Haudkiewiez-Junak D,Grana C,et al.Receptor radionuclide therapy with 90Y-DOTATOC in patients with medullary thyroid carcinomas[J].Cancer Biother Radiophasm,2004,19(1):65-71.

[3]Schmitt A,Bemhardt P,Nilsson O,et al.Radiation therapy of small cell lung cancer with Lu-DOTA-octreotate in an animal model[J].J NucI Med,2004,45(9):1542-1548.

[4]Bushemeyer WC 3rd,Freedland SJ.Obesity and prostate cancer:epidemiology and clinical implications[J].Eur Urol,2007,52(2): 331-343.

[5]侯振江,李永乾.蛋白質組學及其在前列腺癌研究中的應用[J].中華男科學雜志,2006,12(4):358-361.

[6]甘琳,李鳴.雄激素非依賴性前列腺癌發病機制的研究進展[J].中華外科雜志,2007,45(8):562-564.

Synergistic inhibition effects of gemcitabine and octreotide on prostate cancer cell line PC-3.

HAO Ji-dong1,2,SUN Fu-kang1.1.Department of Urology,Ruijin Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025,CHINA;2.Department of Urology,Zhoupu Hospital Affiliated to Shanghai Health University of Medicine, Shanghai 201318,CHINA

ObjectiveTo study the inhibitory effects of gemcitabine cooperated with octreotide on castration resistant prostate cancer cells PC-3 proliferation and the influence on apoptosis.MethodsHuman prostate cancer cell line PC-3 was cultured in vitro in order to investigate the effects of octreotide(0.5μg/mL,1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL, 8μg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on proliferation inhibition and apoptosis-inducing ability in different periods of time.Flow cytometry was applied to study the effects of octreotide(8μg/mL)and gemcitabine (1 μg/mL)alone or combination on PC-3 cell apoptosis.And Western-blot technique was utilized to evaluate the influence of octreotide(8μg/mL)and gemcitabine(1 μg/mL)alone or combination on expression of apoptosis indexes Bax, Bcl-2,Caspase3 and Caspase9.ResultsMTT cell test results showed that after 72 hours,the inhibition ratio was 62% in combined treatment group,significantly higher than that in the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).AnnexinV-FITC cell apoptosis experiment results showed that the apoptosis rate in combined treatment group(25%)was significantly higher than that of the single drug group and control group,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).Western-blot experiment results showed that the Bcl-2 in the combined treatment group was lower than that in other groups,and the expression of Bax,Caspase3 and Caspase9 protein were significantly higher than that in other groups,showing the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe synergistic effect of octreotide and gemcitabine enhanced the proliferation inhibition and apoptosis promotion in human castration resistant prostate cancer cell line PC-3,suggesting that the clinical combination should be feasible for the treatment of castration resistant prostate cancer.

Gemcitabine;Octreotide;Prostate cancer;Proliferation;Apoptosis

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.003

R737.25

A

1003—6350（2017）08—1212—03

2016-09-04)

上海市健康醫學院附屬周浦醫院重點專科建設(編號：ZP-xk-2015C-1)

孫?？?。E-mail：sunfukang6@126.com