高血糖對大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及味蕾的影響

劉彩云，龍明生，董紅，孟楊

(1.湖北醫藥學院附屬東風口腔醫院口腔內科，湖北十堰442000；. 2.武漢大學醫學院口腔解剖生理學教研室，湖北武漢430071)

·論著·

高血糖對大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及味蕾的影響

劉彩云1，龍明生1，董紅1，孟楊2

(1.湖北醫藥學院附屬東風口腔醫院口腔內科，湖北十堰442000；. 2.武漢大學醫學院口腔解剖生理學教研室，湖北武漢430071)

目的探討高血糖對絲狀乳頭、菌狀乳頭及味覺感受器的影響，為臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與治療提供形態學資料。方法30只健康雄性SD大鼠按體質量隨機分為正常對照組(n=14)和糖尿病組(n=16)。以鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/kg一次性腹腔注射建立1型糖尿病模型。普通飼料喂養12周后取舌組織，以亞甲藍染色光鏡下觀察兩組大鼠舌菌狀乳頭數目以及類型。采用HE染色并在光鏡下觀察兩組大鼠菌狀乳頭、味蕾的組織學變化。采用Phtoshop軟件測量味蕾的大小、面積，并以SPSS15.0統計軟件進行數據分析。結果與對照組比較，糖尿病組大鼠味蕾數目減少、味蕾面積顯著縮小(P＜0.01)，但兩組間乳頭總數差異無統計學意義(P＞0.05)；對照組大鼠菌狀乳頭91.1%為有孔菌狀乳頭，8.9%為無孔菌狀乳頭，未發現絲狀樣變的菌狀乳頭；與對照組比較，糖尿病組大鼠有孔菌狀乳頭數僅占59.1%，無孔菌狀乳頭數目顯著增多，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，并且出現絲狀樣變的菌狀乳頭。結論1型糖尿病大鼠味覺感受器表現出一系列萎縮的形態學改變特征；菌狀乳頭味蕾的面積與味覺敏感性相關。

糖尿病；菌狀乳頭；味蕾；味覺

味覺是對動物至關重要的特殊感覺功能，味覺的感受器是味蕾，味蕾是由60～100個味蕾細胞構成的卵圓形小體。在哺乳動物中，味蕾主要分布于菌狀乳頭、葉狀乳頭和輪廓乳頭的上皮內，而絲狀乳頭不具有味覺功能[1]。味覺系統構成一個額外的內分泌調控位點，影響食物攝入，進而調節機體能量平衡[2]。許多因素如年齡、溫度及疾病均可對味覺產生明顯的影響。隨著社會發展，人們飲食結構和生活方式的改變，糖尿病在世界范圍發病率逐年上升，而我國糖尿病患者數量位居全球首位，嚴重危害人民健康[3]。糖尿病主要危害為其各種并發癥，味覺損害正是其中之一。糖尿病患者的甜、咸等味覺敏感性顯著低于健康人群，嚴重影響其生活質量，并因此可能導致其攝入較多的糖、鹽及調味品等從而不利于糖尿病患者的飲食控制。以往對糖尿病與味覺關系的研究多局限于味覺閾和敏感性方面，但糖尿病對味覺感受器形態、功能方面的影響方面的研究仍然少有報道。本研究建立了糖尿病大鼠模型并對高血糖對絲狀乳頭、菌狀乳頭及味覺感受器的形態學影響進行了研究，以期為臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與治療提供形態學方面的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型建立SPF級成年雄性SD大鼠30只(武漢大學醫學院實驗動物中心提供)，體質量210～260 g。將大鼠按體質量隨機分為對照組(n= 14)和造模組(n=16)。大鼠禁食24 h，造模組一次性腹腔注射1%STZ-檸檬酸鹽緩沖液，劑量為60 mg/kg(注射前取-20℃保存的粉劑STZ，以0.1 mmol/L，pH值為4.2的枸櫞酸緩沖液配制)。對照組腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。注射后48 h并禁食4 h后尾靜脈取血，檢測血糖(SureStep血糖儀)，以空腹血糖大于16.7 mmol/L，尿糖3+～4+，出現多飲、多食、多尿等表現并維持一周以上者確定為糖尿病模型建立并作為糖尿病組。模型建立后每周稱量體質量，測定空腹血糖并排除不符合標準的實驗對象(糖尿病組1只造模不成功，中途死亡2只，故糖尿病組納入研究對象13只，對照組14只)。

1.2 標本制備普通飼料喂養，自由進食進水，喂養12周。處死前禁食12 h，自由飲水并稱取體質量，斷尾取血并測定血糖。注射過量的戊巴比妥鈉以深麻醉致死大鼠，快速取出舌組織并制備組織切片，分別以亞甲藍及HE進行染色。

1.3 光鏡觀察以光學顯微鏡下觀察舌組織亞甲藍染色切片，比較兩組大鼠舌菌狀乳頭、味蕾的形態學變化，并對菌狀乳頭、味孔進行計數。觀察舌組織HE染色切片，比較兩組大鼠舌菌狀乳頭、味蕾的形態學變化。

1.4 圖形分析光鏡下對菌狀乳頭味蕾的連續縱切面進行拍照，取味蕾面積最大者以Photoshop軟件測量味蕾長軸、短軸。因菌狀乳頭的味蕾縱切面近似橢圓形，故采用公式“截面積=π×長半軸×短半軸”(π為圓周率)計算味蕾面積。

1.5 統計學方法在同等放大倍數下，隨機選擇20個觀測值用SPSS15.0統計分析軟件進行數據處理。本實驗中的計量數據均以均數±標準差()表示，對相關數據之間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠狀態及體質量、血糖情況對照組SD大鼠攝食、飲水情況、精神狀態及日?；顒泳?，體質量逐漸增加。糖尿病組大鼠在STZ注射后一周內即出現多尿、多飲、多食癥狀，體質量自第2周開始較正常組有所下降。如表1所示，至第12周時，糖尿病組大鼠體質量較正常組明顯下降(P＜0.01)。糖尿病組大鼠血糖較正常組明顯升高，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。

表1 兩組大鼠血糖、體質量測量結果()

表1 兩組大鼠血糖、體質量測量結果()

組別例數實驗前血糖(mmol/L)實驗后血糖(mmol/L)實驗前體質量(g)實驗后體質量(g對照組糖尿病組t值P值14 13 4.1±0.3 4.2±0.1 1.143 0.264 4.2±0.4 25.7±1.6 48.733＜0.01 236.8±9.2 239.4±8.4 0.765 0.451 ) 443.2±7.3 206.1±6.2 90.565＜0.01

2.2 大鼠舌乳頭形態結構改變

2.2.1 亞甲藍染色正常對照組SD大鼠在舌背表面數量較多，呈圓錐狀的為絲狀乳頭。菌狀乳頭散在于絲狀乳頭之間，數量較少、體積較大、頂部呈凸向上的近似半圓形，著色較淺(圖1A)。在菌狀乳頭的頂部中央著色較深，該處即為味孔區域(圖1B)。光鏡觀察發現對照組大鼠菌狀乳頭有兩種形態，即有孔菌狀乳頭和無孔菌狀乳頭，其中有孔菌狀乳頭比例高達91.1%。與對照組比較，糖尿病組菌狀乳頭呈現三種形態：有孔菌狀乳頭、無孔菌狀乳頭和絲狀樣變的菌狀乳頭(圖1C、1D)。如表2所示，其中有孔菌狀乳頭數量僅占59.1%，顯著減少；無孔菌狀乳頭達34.9%，顯著增多；而且還出現了少量絲狀樣變的菌狀乳頭。

表2 兩組大鼠菌狀乳頭的類型和數目比較(，個)

表2 兩組大鼠菌狀乳頭的類型和數目比較(，個)

注：FF：菌狀乳頭。

組別例數有孔FF 無孔FF 絲樣變FF FF總數對照組糖尿病組t值P值14 13 76.58±1.20 47.34±2.31 41.721＜0.001 7.46±0.35 27.93±1.01 71.445＜0.001 0 4.70±0.20 88.065＜0.001 84.04±0.60 79.97±2.03 1.967 0.061

2.2.2 HE染色正常對照組大鼠菌狀乳頭呈蘑菇狀，乳頭表面為較薄的角化上皮，乳頭結締組織內毛細血管較豐富，乳頭頂部上皮內可見味蕾(圖2A)。與對照組比較，糖尿病組觀察到3種形態的菌狀乳頭。(1)有孔菌狀乳頭：菌狀乳頭內含有味蕾及味孔，但菌狀乳頭表面角化層明顯增厚，結締組織內毛細血管減少，味蕾體積縮小(圖2B)。(2)無孔菌狀乳頭：菌狀乳頭內未見味蕾及味孔，菌狀乳頭表面角化層增厚，固有層內未見初級乳頭(圖2C)。(3)絲狀樣改變菌狀乳頭：菌狀乳頭呈尖錐狀隆起，角化層明顯增厚(圖2D)。正常組絲狀乳頭排列有序，統一向舌根方向傾斜(圖3A)，糖尿病組絲狀乳頭排列較雜亂(圖3B)。比較兩組大鼠味蕾面積，對照組大鼠味蕾約(551.32±18.30)μm2，糖尿病組味蕾面積縮小至(265.67±13.24)μm2，差異有統計學意義(P＜0.01)。

圖1 大鼠舌乳頭亞甲藍染色

圖2 大鼠舌菌狀乳頭HE染色

圖3 大鼠舌絲狀乳頭HE染色

3 討論

根據國際糖尿病聯盟的數據，中國糖尿病患者總數近1.1億，已成為全球糖尿病發病的第一大國；且患者仍迅速增加，至2040年預計將達到1.5億，仍居世界首位。糖尿病已經成為我國人民健康造的重大威脅。糖尿病的危害主要在于其多種并發癥。味覺損害也是糖尿病的重要并發癥之一，并長期遭到忽視。Floch等[4]用電味覺和化學測定兩種方法研究了糖尿病對患者味覺的影響，結果顯示糖尿病患者甜、苦、咸、酸四種基本味覺均有減退，有73%的患者味覺受損，而健康人僅為16%，結果還提示味覺損害與糖尿病導致的周圍神經病變相關。味覺損害嚴重影響糖尿病患者生活質量，特別是由于味覺退化，患者較之健康人群傾向于更多地攝取鹽、糖及各類調味品，不利于糖尿病飲食控制，長此以往將加重糖尿病病情。然而，糖尿病引起的味覺損害尚未引起足夠重視，而當味覺功能減退時，國內外目前尚無有效的治療方法。因此，對糖尿病導致味覺損害的機制進行研究對臨床糖尿患者味覺功能紊亂的診斷、評估與早期預防均有重要的意義。

味蕾是味覺的化學感受器，味蕾頂端的味孔和伸入味孔的味毛是味覺產生的起始部位。味物質通過味孔與味細胞頂端微絨毛上的味受體或離子通道受體結合，進而將化學刺激信號傳遞至胞內，隨后味細胞去極化并向與之相連的味覺傳入神經釋放神經遞質并引發神經元興奮，產生的電信號傳入大腦并最終引起味覺?？梢?，味蕾在味覺產生中扮演著至關重要的角色。味蕾的分化、發育及正常形態的維持有賴于味覺神經的支配及營養作用[5]。當神經纖維損傷或切斷時，其支配的味蕾隨之減少甚至消失，而神經重新分布支配時，味蕾再生[6]。哺乳動物的味蕾絕大部分分布于味乳頭尤其是菌狀乳頭中，味蕾的數量、大小及功能取決于味乳頭的健康狀態。有國外研究表明感覺神經纖維在味乳頭特別是菌狀乳頭的形成與發育中起著重要作用[7]。在倉鼠上進行的單側鼓索神經切斷試驗表明[8]：失去鼓索神經支配的菌狀乳頭上味蕾味孔直徑變小，味小管管徑變窄。Sollars等[9]也研究發現：新生大鼠切除單側鼓索神經后該側菌狀乳頭數量減少，味蕾體積縮小，發育受到嚴重影響，提示菌狀乳頭和味蕾的正常發育高度依賴神經支配。

糖尿病導致的神經病變可累及人體神經系統的各個部分，且感覺神經受損早于運動神經，相當一部分患者在糖尿病早期乃至糖耐量受損期就出現了可經肌電圖證實的感覺神經傳導速度減慢。研究表明：糖尿病周圍神經病變患者常合并味覺功能減退[10]。本研究發現：糖尿病組大鼠有孔菌狀乳頭明顯減少且菌狀乳頭味孔密度顯著降低，反之無孔菌狀乳頭、絲狀樣變的菌狀乳頭顯著增多，菌狀乳頭頂部變窄，初級乳頭消失，絲狀乳頭也出現了萎縮等現象；味蕾面積顯著縮小，部分菌狀乳頭內味蕾消失。與正常對照組相比，糖尿病組菌狀乳頭角化層明顯增厚，固有層內未見明顯初級乳頭，味蕾的高度降低，面積顯著縮小。隨著菌狀乳頭及味蕾、味孔的密度降低，味覺化學感受器減少，這直接影響味物質與味細胞、味受體的結合，進而導致味覺功能受損。Patricio等[11]研究發現：糖尿病患者味覺損害可能與味乳頭密度減少有關，本研究結果進一步證實了上述發現。味乳頭及味蕾正常形態和功能的維持高度依賴味覺神經纖維，據此我們進一步推測糖尿病組大鼠味蕾及味乳頭的改變可能與糖尿病導致的味覺神經纖維受損有關，這也為糖尿病患者味覺損害機制研究及防治提供了新的思路。

Schiffman等[12]提出：“味覺是人的大問題和難題，我們可以矯正視力，改善聽力，但是很難恢復我們的味覺”。味覺損害是糖尿病的早期并發癥之一，且與神經損傷密切相關。本研究探討了高血糖對菌狀乳頭、絲狀乳頭及味蕾的影響，為糖尿病導致的味覺損害機制研究和臨床味覺功能紊亂癥的早期診斷與治療以及糖尿病神經損害的早期預警提供了形態學資料。但其具體機制及與糖尿病導致的神經損害間的相互關系仍不明確，有待進一步研究。

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Impact of hyperglycemia on filiform papillae,fungiform papillae and taste buds in rats.

LIU Cai-yun1,LONG Ming-sheng1,DONG Hong1,MENG Yang2.1.Department of Oral Medicine,Dongfeng Stomatology Hospital，Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.Department of Oral Anatomy and Physiology,School of Medicine, Wuhan University,Wuhan 430071,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of hyperglycemia on the filiform papillae,the fungiform papillae and taste buds in rats,so as to provide morphological data for diagnosis,assessment and treatment of diabetics with taste dysfunction.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into control group(n=14)and diabetic group(n=16)according to weight.Type 1 diabetic rats were induced by a single intraperitoneal injection streptozotocin (60 mg/kg).And then rats were fed on regular chow diet for 12 weeks.The tongue tissues were removed after 12 weeks. The number and shapes of fungiform papillae were observed by methylene blue staining and light microscopy.The morphological alterations of fungiform papillae and taste buds were observed by HE staining.Phtoshop software was used to measure the size and area of taste buds.The results were analyzed by the SPSS15.0 statistical software.ResultsCompared with normal controls，the number and area of taste buds in diabetic rats decreased significantly(P＜0.01).However，there was no significant difference in total number of the papillae between the two groups(P＞0.05).Taste pores were found on 91.1%fungiform papillae(poreless papillae was 8.9%),and there was no fungiform papillae with a filiform-like appearance in control rats.Compared with control rats,taste pores were found on 59.1%fungiform papillae in diabetic rats,and the number of poreless papillae was significantly increased(P＜0.01),there was fungiform papillae with filiform-like papillae.ConclusionGustatory receptor of type 1 diabetic rat showed a series of atrophy changes. The area of taste buds on fungiform papillae was associated with taste sensitivity.

Diabetes;Fungiform papillae;Taste buds;Rats;

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.001

R-332

A

1003—6350（2017）08—1205—04

2016-11-16)

湖北省衛生廳科研基金（編號：JXIB068）;湖北省十堰市科技局引導型資助項目（編號：14y5Y51)

孟楊。E-mail:Mengyang56@126.com