茶多酚對過氧化氫損傷PC12細胞抗氧化酶系統的影響

鄧鳳君+肖凌+楊吟宇+文向華

[摘要] 目的 研究茶多酚（TP）對過氧化氫（H2O2）損傷大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞抗氧化酶系統的影響。 方法 PC12細胞用TP及H2O2處理（TP終濃度5、10、20 μmol/L，H2O2終濃度500 μmol/L），以噻唑藍（MTT）法觀察細胞活力，試劑盒測定細胞內抗氧化酶系統超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平。 結果 500 μmol/L H2O2作用PC12細胞2 h，細胞出現明顯損傷，細胞活力下降（P < 0.01）；細胞破碎后上清液中SOD、GSH-Px的活性下降，MDA的水平增高（P < 0.01或P < 0.05）；5、10、20 μmol/L TP預處理可降低受損PC12細胞MDA的水平，增加SOD、GSH-Px的活性（P < 0.01）。 結論 TP能提高受損PC12細胞抗氧化酶系統的作用。

[關鍵詞] 茶多酚；PC12細胞；過氧化氫；抗氧化酶系統

[中圖分類號] R421 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（a）-0020-04

Effects of tea polyphenols on antioxidant enzyme system in PC12 cells damaged by hydrogen peroxide

DENG Fengjun1 XIAO Ling1 YANG Yinyu1 WEN Xianghua2

1.Department of Pharmacy， Yiyang Medical College， Hu'nan Province， Yiyang 413000， China； 2.General Office， Stomatological Hospital Affiliated to Yiyang Medical College， Hu'nan Province， Yiyang 413000， China

[Abstract] Objective To explore the effects of tea polyphenols （TP） on antioxidase system in pheochromocytoma PC12 cells of rats damaged by hydrogen peroxide （H2O2）. Methods PC12 cells was treated with TP and H2O2 （the final concentration of TP was 5， 10， 20 μmol/L， the final concentration of H2O2 was 500 μmol/L）. The cell viability was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） assay. The activity of antioxidase system superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） and glutathion peroxidase （GSH-Px） in PC12 cells was measured by the kits. Results PC12 cells were treated with 500 μmol/L H2O2 for 2 h， which were damaged obviously and the celluar viability was decreased （P < 0.01）； besides， after disruption of cells， the activity of supernatant GSH-Px and SOD was reduced， and the MDA was increased （P < 0.01 or P < 0.05）； while 5， 10， 20 μmol/L of TP pretreatment could decrease the level of MDA and improve the activity of SOD and GSH-Px in the PC12 cells （P < 0.01）. Conclusion TP can enhance the activity of antioxidase system in induced-injury PC12 cells.

[Key words] Tea polyphenols； PC12 cells； H2O2； Antioxidase system

茶多酚（TP）為綠茶的主要活性成分，有顯著的抗氧化作用，作用于與自由基有關的酶，抑制氧化酶系，如抑制氧化酶黃嘌呤氧化酶系（XO）、細胞色素P2450環氧酶等，同時TP通過直接作用于自由基，再生或保護體內高效抗氧化劑、絡合誘導氧化的過渡金屬離子，能高效清除自由基，產生顯著的抗氧化、抗炎等作用[1-3]。本研究用PC12細胞株作為體外實驗的神經細胞，H2O2為誘導損傷劑，造成受損神經細胞體外損傷模型，從TP對抗氧化酶系統的影響等方面研究了TP對神經細胞體外損傷模型的作用。通過本研究，希望為TP用于神經組織損傷性疾病提供切實可信的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 高糖DMEM培養基（GIBCO公司，USA），噻唑藍（MTT，Sigma-Aldrich，USA），二甲基亞砜（DMSO，UNI-CHEM公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物公司）；TP（98%，江西綠康公司），過氧化氫（H2O2，汕頭光華化學廠），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成）。752型紫外分光光度計（上海第二分析儀器廠），酶標儀（Model 680，Bio-RAD，USA），超聲波清洗器（中國華南超聲波設備廠），離心機（TGL-16aR，上海安亭科學儀器廠），倒置相差顯微鏡（XDS-1B，Olympus，日本）。PC12細胞購自中國科學上海細胞生物學研究所細胞庫，源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞。

1.1.2 實驗溶液配制 TP：精確稱取適量，用無血清的DMEM溶解成一定濃度的母液，過濾除菌，用無血清的DMEM稀釋成終濃度為5、10、20 μmol/L的三種濃度，現用現配。H2O2：量取適量后過濾除菌，4℃避光貯存，用前用無血清的DMEM配置成所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 PC12細胞2×105/mL孵育在50 mL培養瓶中，DMEM高糖培養基（含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清），置37℃、5%CO2恒溫培養箱內常規孵育，每24小時換培養液1次，每48小時約80%滿瓶時傳代[4-6]。取對數生長期PC12細胞，以每孔2×105/mL分別接種在96孔板（MTT實驗）或6孔板中（SOD、MDA、GSH-Px測定實驗），于37℃、5%CO2培養箱中進行培養，24 h內細胞達到80%～90%融合后，用DMEM孵育細胞24 h（含體積分數0.01% FBS），同步化細胞。TP（終濃度分別為5、10、20 μmol/L）預孵育細胞1 h，再加入H2O2（終濃度500 μmol/L）共同培養2 h。

1.2.2 建立損傷PC12細胞模型 用MTT實驗確立PC12細胞損傷模型[7]。取對數生長期細胞，接種在96孔板（每孔2×105/mL），如上“1.2.1細胞培養和處理”所述接種孵育與同步化?？瞻讓φ战M加入等量的培養液使H2O2終濃度為0 μmol/L，其余各組分別加入H2O2（終濃度為100～600 μmol/L）孵育2 h，所有組別均設6個平行孔。棄培養液，加終濃度1 g/L MTT 液，培養4 h，棄上清，每孔加DMSO 150 μL，平板震蕩儀輕微震蕩5 min，用酶標儀在570 nm處測定吸光度值。細胞存活率按公式計算：細胞存活率=A570 nm（處理組）/A570 nm（對照組）×100%。

1.2.3 測定受損PC12細胞SOD水平 取對數生長期細胞，接種在6孔板上（每孔2×105/mL），如上“1.2.1”所述接種孵育與同步化。分為5組，空白對照組（加等量的培養液）、H2O2組（即模型組，僅加終濃度500 μmol/L H2O2）以及3種不同濃度的TP組（加入TP使終濃度為5、10、20 μmol/L，預孵育1 h，再加終濃度500 μmol/L H2O2共同孵育2 h），5組各設3個平行孔。棄培養液，0.125%胰蛋白酶使細胞脫壁，每孔細胞數為（1～5）×106，1500 r/min（離心力151×g，離心半徑6 cm），離心5 min，收集細胞至0.5 mL裂解緩沖液（0.1 mol/L PBS中含0.5% Triton X-100，pH 7.0），用超聲粉碎儀破碎細胞，直到顯微鏡下觀察大部分細胞已破碎，1200 r/min（離心力97×g，離心半徑6 cm）4℃離心20 min，取細胞破碎后上清，按照試劑盒說明進行測試。

1.2.4 測定受損PC12細胞MDA水平 按照“1.2.3”法收集細胞破碎后的上清液，根據試劑盒說明進行測試。

1.2.5 受損PC12細胞GSH-Px活性的測定 按照“1.2.3”法收集細胞破碎后的上清液，根據試劑盒說明進行測試。

1.3 統計學方法

統計處理采用SPSS 16.0軟件完成，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，數據分析采用One-way ANOVA分析，各組之間多重比較采用LSD或Dunnett多重比較法，采用LSD多重比較法分析SOD和MDA實驗結果，Dunnett T3多重比較法分析GSH-Px實驗結果。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2對PC12細胞活力的影響

空白對照組（即0 μmol/L組）細胞形態完整體積飽滿，而損傷組細胞間隙增大，體積明顯縮小，表面變光滑，突起消失，出現不同程度損傷，損傷程度以600 μmol/L最嚴重，見圖1。數據分析也顯示，PC12細胞被H2O2孵育2 h，細胞活力下降，與空白對照組比較，100～300 μmol/L劑量H2O2能降低細胞活力，但是差異無統計學意義（P > 0.05），400～600 μmol/L劑量H2O2能降低細胞活力，差異有高度統計學意義（P < 0.01），見表1。本研究采用了500 μmol/L劑量作為誘導PC12細胞損傷劑量。

2.2 TP對抗氧化酶系統的影響

H2O2損傷PC12細胞后，顯著抑制了細胞的SOD、GSH-Px活性，升高了MDA水平，H2O2組與空白對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。TP預孵育1 h，TP三個濃度組細胞內SOD、GSH-Px活性上升，MDA水平下降，與H2O2組比較差異有高度統計學意義（P < 0.01），見表2。說明TP能顯著提高受損細胞內抗氧化酶SOD、GSH-Px水平，有效拮抗H2O2導致的受損細胞內抗氧化酶系統水平的降低。

3 討論

茶作為藥用已有千年歷史，其藥用價值已經得到全世界廣泛認同。目前已經開發出了具有藥用價值的牙膏與洗發水等產品。茶中具有藥用價值的活性成分主要是TP。它是新型高效天然的抗氧化劑，能有效清除體內自由基，具有護膚、護發、防癌、提高免疫力、抗衰老、降血脂等一系列優異功能[8]。尤其因其具有顯著抗氧化作用，TP拮抗氧自由基介導的疾病是目前醫學研究的活躍領域，而且TP能透過血腦屏障，緩解脂質過氧化狀態[9]，因此我們假定它也許是治療神經細胞損傷的備選藥物。

本研究采用500 μmol/L H2O2作為外源性活性氧族（ROS）造成PC12細胞損傷，通過預孵TP，探索TP對細胞內抗氧化酶系統的影響。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株，普遍被用來研究多種神經系統疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等[10-12]。H2O2能夠穿透并且損傷生物膜、線粒體，亦是最主要、最穩定的ROS家族成員，因而H2O2常常作為毒性物質來模擬氧化應激體外模型[13-16]。因而，本研究通過PC12細胞被H2O2誘導損傷，造成神經損傷體外模型，來評價TP對受損神經細胞抗氧化酶系統的影響。

正常組織在氧化代謝過程中會有少量的自由基產生，同時細胞內存在一系列有效的抗氧化防御系統，用以減少自由基在有氧代謝過程中對細胞的損害，維持氧自由基的代謝平衡，其中包括清除ROS的SOD、GSH-Px等[17-18]。機體清除氧自由基能力愈強，SOD與GSH-Px活性愈高，而MDA為自由基作用于膜脂質發生過氧化反應的最終產物，具有細胞毒性，其水平反映了細胞受自由基攻擊的嚴重程度[19]。本研究發現，H2O2孵育PC12細胞2 h，能降低細胞內SOD、GSH-Px活性，升高MDA水平。而給予TP處理后，受損細胞內SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平下降。此結果說明TP能提高受損PC12細胞內抗氧化酶系統的作用。

綜上所述，通過對受損P12細胞氧化酶系統影響的實驗，顯示TP能提高受損P12細胞內抗氧化酶系統活性，結合本課題的其他研究結果[20]，揭示TP對受損神經細胞有一定的保護作用，其可能的機制之一是TP能提高受損PC12細胞內的抗氧化酶系統活性。但TP抑制H2O2誘導PC12細胞損傷的分子信號等機制尚需進一步的研究。

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