B7-H1對脂多糖所致膿毒癥小鼠T細胞增殖的影響

王 方

南陽醫學高等專科學校基礎部

B7-H1對脂多糖所致膿毒癥小鼠T細胞增殖的影響

王 方

南陽醫學高等專科學校基礎部

目的觀察B7-H 1對脂多糖所致膿毒癥小鼠T細胞增殖的影響。方法脂多糖刺激小鼠樹突狀細胞造膿毒癥免疫麻痹模型，使用光學顯微鏡、流式細胞術和BrdU細胞增殖反應試劑盒分別檢測樹突狀細胞分化、B7-H 1表達水平及T淋巴細胞增殖反應的情況。結果脂多糖促進樹突狀細胞成熟，且B7-H 1表達平均熒光密度值由12.39增加到43.81，p＜0.001；然而T淋巴細胞反應抑制，OD值由0.761減少為0.374，并且封閉B7-H 1后反應活化，OD值由0.352增加到0.607，p＜0.001。結論免疫共抑制分子B7-H 1是脂多糖所致膿毒癥小鼠T細胞增殖反應低下的主要誘因。

B7-H 1；脂多糖；膿毒癥；樹突狀細胞

Fund project：Henan province basic and advanced technology research project plan pro ject（152300410018）and Nanyang science and techno logy attack plan p roject（2015KJGG18）.

1.前言

膿毒癥（sepsis）是由感染和創傷等引起細菌等入侵誘發的全身炎性反應和組織器官繼發性損傷的病理生理過程及臨床癥候群，病死率高，是重癥監護病房（intensive care unit,ICU）難以攻克的醫學難題之一[1]。膿毒癥的發生與腸中血中脂多糖（lipopoiysaccharide,LPS）有密切關系[2]，并且免疫麻痹可能是參與膿毒癥致病過程的主要因素之一。樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）是最為強大的抗原提呈細胞（antigen presenting cell,APC）[3]，DCs表面的B7H1（B7-homolog1）是程序性細胞死亡-1受體（programmed cell death 1,PD-1）的配體即PD-L1（programmed death-1-ligand 1），與活化T細胞受體PD-1結合后抑制T細胞反應，呈現“免疫麻痹”－一種低下的炎癥反應[4]。本研究以LPS刺激DCs建立膿毒癥免疫麻痹模型，探討B7-H1在LPS所致DCs免疫麻痹中的作用，為臨床上膿毒癥所致免疫麻痹的治療探尋潛在分子靶點。

2.資料與方法

2.1 主要試劑與動物rmGM-CSF和rm IL-4購自美國Peprotech公司。流式檢測PE標記B7-H1抗體及同型對照抗體購自美國eBioscience公司。Real-time PCR試劑購自中國大連Tarkara公司。BrdU細胞增殖檢測試劑盒購于美國Roche公司。C57BL∕6（H-2Kb）近交系小鼠，4-6周左右，雌性。購自中國科學院上海實驗動物中心。

2.2 DCs的體外誘導和分組根據文獻報道[4]培養板調整小鼠骨髓來源單核細胞密度約為1*106個∕ml，加入DCs專用培養基、rmGM-CSF和rm IL-4，4天后棄去懸浮細胞，得到未成熟DCs。實驗組加入10ng∕ml LPS刺激12小時，對照組不加LPS。

2.3 DCs的分化和B7-H1表達檢測按照2.2方法常規誘導，4天后換新鮮培養液，加LPS（10ng∕m l）刺激12小時，用光學顯微鏡觀察DCs形態變化。收集計數細胞，冷PBS洗滌，B7-H1熒光抗體4℃避光孵育細胞30分鐘，洗滌重懸細胞，上機檢測。

2.4 T淋巴細胞增殖反應DCs負載抗原SIINFEKL（2μg∕m l），計數調整細胞濃度為5×105個∕100ul作為刺激細胞，其中B7-H1封閉抗體（10F.9G2）按0.5μg∕100ul，培養箱封閉約30分鐘。無菌取C57BL∕6小鼠脾臟，研磨離心并裂解紅細胞，調整為5×106個∕m l作為效應細胞。按刺激細胞：效應細胞=1：10總體積為200μl混合于96孔圓底板中，培養箱靜置培養4天。按照BrdU細胞增殖檢測試劑盒說明書流程操作讀取OD值。

2.5 統計方法各組計量資料以均數（mean）±標準差（SD）表示。應用GraphPad Prism 5進行統計分析，組間均數采用t檢驗或單因素方差分析Newman-Keuls檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 脂多糖誘導樹突狀細胞成熟和T細胞免疫麻痹Fig-1.LPStreatmentcould augmentDCs’maturation and suppress T lymphocytesproliferation.（A.LPS促進DCs分化；B.LPS抑制T淋巴細胞活化增殖）（A.LPSpromoted DCs’polarization bymicroscopic imaging technique；B.LPS suppressed T lymphocytes proliferation by BrdU Cell Proliferation assay）

圖2 脂多糖上調B7-H1抑制抗原特異性T細胞增殖Fig.2 LPStreatmentcould improve B7-H1 expression themolecularwhich played T lymphocytesproliferation suppression.（A-B.流式細胞術檢測B7-H1表達百分比和平均熒光密度值；C.BrdU細胞增殖反應檢測封閉B7-H1后抗原特異性T細胞增殖反應OD值）（A-B.B7-H1 positive percentageandmean fluorescent intensity valuewere detected by flowcytometry；C.T lymphocytesproliferationwith B7-H 1 blocking antibodywas detected by BrdU cell proliferation assay）

3.結果

3.1 脂多糖刺激DCs分化和T細胞增殖情況。顯微鏡觀察顯示：對照組DCs細胞呈半懸浮集落式生長，出現偽足和刺狀突起。當加入LPS 12小時后，細胞重新貼壁，部分呈長梭形、條索狀（見圖1A）。T細胞增殖反應顯示，OVA負載組、LPS刺激OVA負載組均能明顯誘導淋巴細胞增殖反應，OD值分別為0.761，0.374。但LPS刺激OVA負載組的增殖反應水平（0.374）遠低于OVA負載組（0.761），差異具有統計學意義（p＜0.001，單因素方差分析，見圖1B），表明LPS刺激促進DCs的分化成熟但抑制T細胞活化增殖，建立膿毒癥免疫麻痹模型。

3.2 脂多糖上調B7-H 1抑制T細胞增殖反應。流式細胞術檢測顯示LPS刺激后DCs表達B7-H1蛋白的陽性細胞百分比由對照組100%增加到147%，平均熒光密度值（MFI）由對照組12.49增加到43.48，具有顯著差異（p＜0.001，t檢驗，見圖2A-B）。BrdU細胞增殖反應結果顯示，SIINFEKL負載組、LPS刺激SIINFEKL負載組和LPS刺激SIINFEKL負載并封閉B7-H1組均能明顯誘導T淋巴細胞增殖反應，OD值分別為0.801，0.352，0.607。而LPS刺激SIINFEKL負載并封閉B7H1組的增殖反應水平（0.607）高于LPS刺激SIINFEKL負載組（0.352），差異具有統計學意義（p＜0.001，單因素方差分析，見圖2C）。以上結果表明LPS刺激顯著上調DCs共抑制分子B7H1抑制抗原特異性T細胞反應。

4.討論

免疫麻痹是一種獲得性免疫缺陷狀態，涉及抗原提呈細胞、效應細胞、細胞因子、共刺激分子、調節性T細胞等免疫組分及整個網絡的交互復雜作用過程。淋巴細胞亞群功能轉換是感染后免疫麻痹的重要機制。本實驗以脂多糖刺激小鼠樹突狀細胞造膿毒癥免疫麻痹模型，發現LPS刺激高表達B7H1的DCs抑制T淋巴細胞反應水平，呈現免疫麻痹狀態。免疫學研究也發現，在膿毒癥病理條件下，DCs介導的免疫反應受到嚴重抑制。令人欣喜的是通過封閉抗體阻斷B7H 1能夠顯著提高低下的T淋巴細胞反應水平。

LPS是細菌內毒素的主要成分，能刺激多種炎癥介質釋放，不僅能夠通過TLR4促進DCs的成熟及T細胞的活化，而且可促進DCs介導的抗原交叉提呈。然而本研究發現LPS抑制DCs介導的T淋巴細胞反應引起免疫麻痹。對在細菌膿毒癥的研究中也證實，細菌及其產物LPS通過TLR4-TRIF信號麻痹DCs抑制CTL反應。因此阻斷TLR信號可以作為治療膿毒癥的有效方法之一。

B7-H1∕PD-1負性調控因子是近幾年腫瘤免疫醫藥領域的研究熱點。B7H1主要表達于小鼠DCs等免疫細胞上，與活化T細胞受體PD-1結合后，可通過誘導凋亡及阻止細胞周期而抑制T細胞反應，在T細胞增殖抑制、凋亡或失能中扮演重要角色。本研究發現LPS抑制DCs介導T淋巴細胞反應，呈現免疫麻痹，當使用B7H1封閉抗體阻斷與T細胞的結合后，低下的T淋巴細胞反應水平升高。因此B7-H1可作為臨床上膿毒癥以及革蘭氏陰性細菌感染所致免疫麻痹治療的潛在分子靶點，以期改善患者預后。

[1]Hotchkiss RS,Coopersmith CM,McDunn JE,Ferguson TA. The sepsis seesaw：tilting toward immunosuppression[J].Nat.Med，2009；15：496-497.DOI：10.1038∕nm0509-496.

[2]Buras JA,Holzmann B,Sitkovsky M.Animalmodels of sepsis：setting the stage[J].Nat.Rev.Drug Discov，2005；4：854-865.DOI：10.1038∕nrd1854.

[3]Lin，M.L，Zhan，Y，Villadangos，J.A，and Lew，A.M.The cellbiology of cross-presentation and the role ofdendritic cellsubsets[J].Immunol.Cell Biol，2008；86：353-362.DOI：10.1038∕icb.2008.3.

[4]Wang，F，Wang，YY，Li J，etal.Increased Antigen Presentation but Impaired TCells Priming after Upregulation of Interferon-Beta Induced by Lipopolysaccharides Is Mediated by Upregulation of B7H1 and GITRL[J].PLOSONE，2014，9（8）：e105636.DOI：10.1371∕journal. pone.0105636.

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（編號：152300410018）和南陽市科技攻關計劃項目（編號2015KJGG18）資助。