殼聚糖堿性氨基酸衍生物的合成及抑菌活性研究

黃 勇, 劉 松, 秦玉坤, 邢榮娥, 李克成, 于華華, 岳 洋, 李 儼, 李鵬程

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殼聚糖堿性氨基酸衍生物的合成及抑菌活性研究

黃 勇1, 2, 劉 松1, 秦玉坤1, 邢榮娥1, 李克成1, 于華華1, 岳 洋1, 2, 李 儼1, 2, 李鵬程1

(1. 中國科學院海洋研究所, 山東青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

利用接枝反應, 采用堿性氨基酸修飾殼聚糖, 制備殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖精氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物。通過紅外(FT-IR)、核磁(1H-NMR)、元素分析(EA)對其進行表征, 并研究了不同殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性。結果表明, 殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖精氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物、殼聚糖對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為320、160、320、640 μg/mL, 對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為320、320、320、640 μg/mL, 三種殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性均明顯高于未修飾殼聚糖。通過引入堿性氨基酸增加殼聚糖的正電荷有利于提高其抑菌活性。

殼聚糖; 堿性氨基酸; 衍生物; 抑菌活性

殼聚糖是甲殼素部分或完全脫乙酰基后的產物, 是自然界中唯一的天然堿性多糖, 具有使用安全、良好的生物相容性、生物降解性和理化性質相對穩定等優點, 同時具有降血脂、絮凝、止血、抗菌等多種生物活性[1]。殼聚糖具有的活潑羥基和氨基, 可以進行多種化學改性, 以改善其溶解性、增強抗菌活性等, 因此在抗菌劑的研究與應用方面具有良好的前景。目前, 雖然殼聚糖及其衍生物的抗菌機理尚沒有明確的結論, 但研究者提出了多種可能的殼聚糖抗菌作用機理, 這些機理都與殼聚糖的氨基或正電荷有關[2]。歸結起來主要有以下三種: 首先最認同的抗菌機理是帶正電荷的殼聚糖與帶負電荷的細菌細胞表面的相互作用, 通過影響細菌代謝而達到抑菌效果[3-5]; 第二個可能的抗菌機理是殼聚糖穿透細胞壁和細胞膜進入細菌細胞內部, 與DNA結合阻止了DNA的轉錄[6]; 第三個可能的抗菌機理是殼聚糖及其衍生物與金屬離子螯合, 抑制微量元素的攝取以及與細菌生長所必需的營養物質結合, 從而達到抑菌效果[7]。

氨基酸作為生物功能大分子的基本組成單位, 是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。而賴氨酸、精氨酸、組氨酸因其側鏈分別帶氨基、胍基和咪唑基(堿性基團), 使其成為帶正電荷的堿性氨基酸[8]。本文利用活性基團拼接原理, 通過接枝反應, 將這三類堿性氨基酸接枝到殼聚糖上, 理論上可以增加殼聚糖上正電荷, 從而提高其抑菌活性。

1 實驗部分

1.1 主要藥品與試劑

殼聚糖(CS, 相對分子質量1300 KDa, 脫乙酰度85.6%), 購于青島云宙生物科技有限公司; 賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His), 嗎啉乙磺酸(MES), 購于國藥試劑集團有限公司; 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS), 購于阿拉丁試劑有限公司, 透析袋(MEMBRA-CEL, 截留分子質量為3500 Da)購于濟南邦達醫藥公司。

1.2 主要儀器與設備

78-1型磁力加熱攪拌器, 常州國華電器有限公司; PHS-3C型pH計, 上海雷磁公司; TU-1810型紫外可見分光光度計, 北京普析通用儀器有限責任公司; iMark酶標儀, 美國美國BIO-RAD公司; FD-1型冷凍干燥機, 北京德天佑實驗儀器有限公司; SARTORIUS 精密分析天平, 德國 SARTORIUS 公司; 博訊立式蒸汽壓力滅菌器, 上海博訊實業有限公司; 紅外光譜儀(Nicolet Magna-Avatar 360), Nicolet Magna公司; 核磁共振光譜儀(JNM-ECP600 NMR spectrometer), 日本JEOL公司; 元素分析儀(Vario EL-Ⅲ elemental analyzer), 德國元素分析系統公司。

1.3 殼聚糖氨基酸衍生物的合成

參照前期已報道的制備方法并進行適當改進[9]。稱取0.5 g殼聚糖溶于50 mL0.10 mol/L MES緩沖溶液中(pH=5.5), 待殼聚糖完全溶解, 加入殼聚糖單元物質的量3倍的EDCl作縮合劑、殼聚糖單元物質的量3倍的NHS作偶聯劑, 攪拌均勻, 加入殼聚糖單元物質的量2倍的氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸), 磁力攪拌, 室溫反應24 h。反應結束后, 于去離子水中透析3 d, 真空冷凍干燥得樣品CS-L(殼聚糖賴氨酸衍生物), CS-A(殼聚糖精氨酸衍生物), CS-H(殼聚糖組氨酸衍生物)。殼聚糖氨基酸衍生物的合成路線如圖1所示。

1.4 抑菌實驗

細菌最小抑菌濃度(MIC)采用微量肉湯稀釋法測定[10]。具體步驟如下:

(1) 用接種環挑取37℃過夜培養的MH瓊脂培養皿上的單菌落于無菌的0.85%生理鹽水中, 校準為0.5麥氏比濁標準, 約含菌數1×108CFU/mL, 然后用MHB培養基稀釋100倍, 即得到約含菌數1×106CFU/mL的菌液, 備用。

(2) 將待測樣品用0.5%乙酸配制成濃度為5 120 μg/mL儲備液。取無菌的96孔板, 每個孔中加入100 μL含菌數1×106CFU/mL的菌懸液, 在A孔中加入100 μL待測樣品儲備液, 混勻, 從A孔吸取100 μL加入B孔, 混勻, 再從B孔吸取100 μL至C孔, 依次類推, G孔吸取100 μL棄去, H孔不加樣品, 只含100 μL菌懸液。此時各孔藥物濃度依次為: 2 560、1 280、640、320、160、80、40 μg/mL。以只加100μL菌懸液不加待測樣品作對照。用酶標儀620 nm波長下測定初始吸光度值, 將96孔板于37℃細菌培養箱培養18~24 h后再用酶標儀620 nm波長下測定吸光度值, 兩次測得的吸光度差δ值代表細菌的生長情況。所測樣品對細菌的抑制率按下式計算:

抑制率=(δ0–δx)/δ0×100%

其中,δ0為只含菌懸液的空白對照培養前后吸光度差值,δx為所測樣品培養前后吸光度差值。

2 結果與分析

2.1 紅外光譜(FT-IR)測定

殼聚糖(CS)和三類氨基酸修飾殼聚糖(CS-L, CS-A, CS-H)的紅外光譜如圖2所示, 從圖中可以看出, 反應后在1 640 cm–1和1 540 cm–1附近出現明顯的吸收峰, 經分析可知, 1 640 cm–1和1 540 cm–1附近分別是仲酰胺的酰胺Ⅰ代吸收峰和酰胺Ⅱ代的N-H變形振動吸收峰, 而原殼聚糖上1589cm–1的氨基(N-H)譜帶被新生成的酰胺Ⅱ譜帶所掩蓋, 這說明反應后產物中有酰胺鍵生成[11]。證明三種氨基酸通過α-羧基與殼聚糖上氨基發生反應, 生成酰胺鍵, 氨基酸修飾殼聚糖成功。

2.2 核磁共振譜圖(1H-NMR)測定

圖3為殼聚糖(CS)和三類氨基酸修飾殼聚糖(CS-L, CS-A, CS-H)的1H-NMR譜圖, 在CS譜圖上, 1.80×10–6處為殼聚糖上未脫乙酰基團質子吸收峰, 2.93×10–6處為C2上質子的吸收峰, 4.65×10–6處為C1上質子的吸收峰, 3.47×10–6~3.66×10–6為C3、C4、C5、C6上質子的重疊吸收峰[12]。經氨基酸修飾的殼聚糖的1H-NMR 除了保持原來的吸收峰外, CS-L的譜圖在1.25×10–6, 1.54×10–6, 1.71×10–6, 2.52×10–6處出現的吸收峰分別對應C9, C10, C8, C11上質子; CS-A的譜圖在1.47×10–6, 1.62×10–6, 2.52×10–6出現的吸收峰分別對應C9, C8, C10上的質子; CS-H的譜圖在2.92×10–6處出現的吸收峰對應C8上的質子, 在7.00×10–6和8.14×10–6處出現的吸收峰分別對應組氨酸咪唑環上C10和C9的質子吸收峰[13]。CS-L, CS-A, CS-H的C7位上質子吸收峰出現在3.40×10–6~ 3.80×10–6, 與殼聚糖骨架上質子出峰位置接近, 可能被殼聚糖骨架上質子吸收峰所掩蓋, 由此可以判定殼聚糖主鏈中成功引入氨基酸分子, 殼聚糖堿性氨基酸衍生物制備成功。

2.3 元素分析

殼聚糖與三類殼聚糖氨基酸衍生物元素分析結果如表1所示。根據C/N比值計算得出殼聚糖脫乙酰度及氨基酸對殼聚糖的取代度, 根據元素分析計算得到的結果表明, 在本實驗條件下制得的三類殼聚糖氨基酸衍生物具有相似的取代度, 由于氨基酸分子的引入, N元素含量增加, C/N降低。

2.4 抑菌實驗

殼聚糖及三類殼聚糖氨基酸衍生物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如表2所示。CS對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)為640 μg/mL, 三類殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性均高于殼聚糖原料, 其中CS-A抑菌活性最高, 對金黃色葡萄球菌的MIC為160 μg/mL, CS-L、CS-H對金黃色葡萄球菌的抑菌活性相當, 其MIC為320 μg/mL。

殼聚糖及三類殼聚糖氨基酸衍生物對大腸桿菌的抑菌效果如表3所示, CS對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為640 μg/mL, 三類殼聚糖氨基酸衍生物的抑菌活性相當, 均高于殼聚糖原料, 其對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為320 μg/mL。

表1 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖元素分析

表2 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖對金黃色葡萄球菌的抑菌率(%)

表3 殼聚糖及賴氨酸、精氨酸、組氨酸修飾殼聚糖對大腸桿菌的抑菌率(%)

3 討論

利用賴氨酸、精氨酸、組氨酸三類帶正電荷的堿性氨基酸修飾殼聚糖, 通過紅外(FTIR)、核磁(1H-NMR)、元素分析(EA)進行結構鑒定、表征, 結果表明三類殼聚糖氨基酸衍生物制備成功。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性的研究結果表明, 三類殼聚糖氨基酸衍生物均能有效提高殼聚糖的抑菌活性。其中, 殼聚糖賴氨酸衍生物、殼聚糖組氨酸衍生物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性相當, 均高于殼聚糖但低于殼聚糖精氨酸衍生物。三類殼聚糖氨基酸衍生物對大腸桿菌的抑菌活性均高于殼聚糖。其原因可能是殼聚糖接枝堿性氨基酸后, 增加了其氨基正電荷, 使其抑菌活性有不同程度的提高。

殼聚糖精氨酸衍生物含有胍基基團, 而胍基化合物常用作農業殺菌劑和消毒劑及工業生物殺傷劑中的抗微生物劑等。這是由于胍基化合物中的胍基團是有效的活性基團, 可以與生物體中的基團或元素相互作用, 破壞其正常的物質和能量代謝[14]; 同時, 精氨酸側鏈胍基基團是具有生物活性最強的有機堿之一[15], 其pKa=12.48, 而賴氨酸側鏈氨基pKa= 10.53, 組氨酸側鏈咪唑基pKa=6.00[8], 就其酸堿性質而言, 精氨酸堿性最強, 攜帶正電荷的能力也最強, 因而賦予殼聚糖精氨酸衍生物更高的抑菌活性。

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Synthesis and antibacterial activities of basic amino acid- modified chitosan derivatives

HUANG Yong1, 2, LIU Song1, QIN Yu-kun1, XING Rong-e1, LI Ke-cheng1, YU Hua-hua1, YUE Yang1, 2, LI Yan1, 2, LI Peng-cheng1

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study, three basic amino acids were used to modify chitosan to improve its antibacterial activity. Lysine-modified chitosan, arginine-modified chitosan, and histidine-modified chitosan were synthesized, and their structures were characterized using Fourier-transform infrared, magnetic resonance spectra (1H-NMR), and elemental analysis. The results showed that the amino acids were successfully grafted onto chitosan. The antibacterial activities of these derivatives againstandwere investigated. The MIC of lysine-modified chitosan, arginine-modified chitosan, and histidine-modified chitosan onwas 320, 160, 320, and 640 μg/mL, respectively, and the MIC onwas 320, 320, 320, and 640 μg/mL, respectively. All three basic amino acid-modified chitosan derivatives exhibited better antibacterial activity than chitosan.

Chitosan; basic amino acids; derivatives; antibacterial activity

Q503

A

1000-3096(2017)01-0024-06

10.11759/hykx20160408001

2016-04-08;

2016-06-26

中國科學院STS計劃項目(KFJ-SW-STS-143); 國家海洋公益性項目(201305016-2、201405038-2); NSFC-山東聯合資助項目(U1406402-5)

黃勇(1990-), 山東濰坊人, 碩士研究生, 研究方向: 海洋活性物質, 電話: 0532-82898780, E-mail: huangyongno1@163.com; 劉松, 通信作者, 研究方向: 海洋活性物質, 電話: 0532-82898780, E-mail: sliu@qdio.ac.cn

Apr. 8, 2016

[CAS STS Program, No.KFJ-SW-STS-143; The Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean, No.201305016-2, No.201405038-2; NSFC-Shandong Union project, No. U1406402-5]

(本文編輯: 康亦兼)