氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠的抗癲癇作用及對(duì)腦組織內(nèi)mGluR5、mGluR1表達(dá)的影響

荊麗麗， 高平，解水杉，曹慶華(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東煙臺(tái) 264100)

氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠的抗癲癇作用及對(duì)腦組織內(nèi)mGluR5、mGluR1表達(dá)的影響

荊麗麗， 高平，解水杉，曹慶華
(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東煙臺(tái) 264100)

目的 探討氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠的抗癲癇作用及對(duì)腦組織內(nèi)代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)及代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)表達(dá)的影響。方法 選擇健康雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)、戊四氮致癇組(12只)、氯喹干預(yù)組(12只)。對(duì)照組：腹腔注射生理鹽水，40 mg/kg，1次/24 h；戊四氮致癇組與氯喹干預(yù)組：腹腔注射0.5%戊四氮溶液，40 mg/kg，1次/24 h。連續(xù)給藥，直至動(dòng)物模型制備成功。模型制備成功后，氯喹干預(yù)組腹腔注射0.5%氯喹，40 mg/kg，1次/24 h，持續(xù)2周。干預(yù)結(jié)束后，觀察并記錄各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，采用Western blotting法檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)mGluR5蛋白的相對(duì)表達(dá)量，免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)mGluR1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 對(duì)照組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，戊四氮致癇組可見點(diǎn)頭、面部抽動(dòng)、前肢陣攣及全身陣攣、跌倒等表現(xiàn)，氯喹干預(yù)組癲癇發(fā)作程度較戊四氮致癇組減輕。與對(duì)照組、氯喹干預(yù)組相比,戊四氮致癇組mGluR5及mGluR1蛋白相對(duì)表達(dá)量增多(P均<0.05)；氯喹干預(yù)組與對(duì)照組相比，P均>0.05。結(jié)論 氯喹能夠減輕戊四氮慢性致癇大鼠的癲癇發(fā)作，抑制腦組織內(nèi)mGluR5及mGluR1的表達(dá)。

癲癇；氯喹；戊四氮；代謝型谷氨酸受體5；代謝型谷氨酸受體1；大鼠

癲癇是慢性反復(fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，是以腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病原因極其復(fù)雜。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡在癲癇中的作用尤為重要。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)包括谷氨酸(Glu)和天門冬氨酸，Glu廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過與Glu受體結(jié)合發(fā)揮作用。Glu受體包括離子型谷氨酸受體、代謝型谷氨酸受體(mGluR)。mGluR可借由間接代謝活動(dòng)進(jìn)行活化，該受體又分為8種不同的亞型(mGluR1～8)，分3組，其中第Ⅰ組包括mGluR1及mGluR5，與G蛋白相偶聯(lián)發(fā)揮作用。氯喹作為傳統(tǒng)的抗瘧疾藥物，其具有廣泛的藥理作用，可抑制DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等。前期研究[1～3]表明，氯喹可以抑制mGluR及神經(jīng)性一氧化碳合酶等的表達(dá)，從而控制戊四氮導(dǎo)致的大鼠癲癇發(fā)作。氯喹是否可以通過抑制mGluR5及mGluR1的表達(dá)，從而達(dá)到抑制癲癇發(fā)作的目的，尚未見研究報(bào)道。2015年1月～2016年12月,本研究探討了氯喹對(duì)戊四氮慢性致癇大鼠的抗癲癇作用及對(duì)腦組織內(nèi)mGluR5及mGluR1表達(dá)的影響，以期對(duì)癲癇的治療提供有價(jià)值的資料。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇SPF級(jí)健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量120～150 g，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，每天稱重,SD大鼠購(gòu)自山東煙臺(tái)綠葉制藥有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)20030008；戊四氮、氯喹(美國(guó)Sigma公司)；兔抗mGluR5抗體、兔抗mGluR1抗體、兔抗β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)；HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)(日本Olympus)。

1.2 戊四氮癲癇大鼠模型制備及分組 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)、戊四氮致癇組(12只)、氯喹干預(yù)組(12只)。對(duì)照組：腹腔注射生理鹽水，40 mg/kg，1次/24 h；戊四氮致癇組與氯喹干預(yù)組：腹腔注射0.5%戊四氮溶液，40 mg/kg，1次/24 h。連續(xù)給藥，直至動(dòng)物模型制備成功。觀察藥物注射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)，每次觀察至給藥后2 h，連續(xù)給藥7 d左右，大鼠出現(xiàn)癇樣發(fā)作，持續(xù)給藥，觀察并記錄行為學(xué)表現(xiàn)，采用Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，至少連續(xù)出現(xiàn)5次Ⅱ級(jí)以上癇樣發(fā)作的大鼠被認(rèn)為造模成功。模型制備成功后，氯喹干預(yù)組腹腔注射0.5%氯喹，40 mg/kg，1次/24 h，持續(xù)2周。Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無發(fā)作；Ⅰ級(jí)：面部肌肉、口部或耳部出現(xiàn)節(jié)律性抽動(dòng)、陣攣；Ⅱ級(jí)：面部肌肉抽動(dòng)陣攣嚴(yán)重，伴點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：前肢陣攣，不伴直立；Ⅳ級(jí)：前肢陣攣并伴直立；Ⅴ級(jí)：全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作、跌倒。

1.3 腦組織內(nèi)mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用Western blotting法。檢測(cè)大鼠按實(shí)驗(yàn)分組，冰上快速開顱取腦，分離腦組織，加入裂解液裂解約30 min，移液，4 ℃離心機(jī)離心(12 000 r/min，5 min)，留上清液，分裝。選用BCA法測(cè)定蛋白濃度，確定上樣體積(含20 μg蛋白)。采用8% SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)預(yù)染Marker確定mGluR-5及β-actin的位置，并剪下相應(yīng)位置蛋白凝膠條帶，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，免疫雜交反應(yīng)。于37 ℃封閉液中封閉2 h，加入山羊抗mGluR5抗體(1∶100)、兔抗β-actin(1∶100)，4 ℃過夜，加入相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，曝光。PVDF膜曬干，條帶掃描，分析灰度值，以mGluR5與β-actin的灰度值之比作為目的蛋白的表達(dá)量。

1.4 腦組織內(nèi)mGluR1蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用免疫組化法。按照試驗(yàn)分組，應(yīng)用4%水合氯醛麻醉，冰上快速開顱取腦，分離提取腦組織，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，切片，厚度3 μm，烤片，浸入二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水。3% H2O2作用20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，檸檬酸高壓修復(fù)，羊血清封閉，加入兔抗mGluR5抗體(1∶200)4 ℃過夜，加入即用型二抗檢測(cè)試劑盒，37 ℃水浴鍋孵育，DAB顯色。復(fù)染、鹽酸分化、乙醇脫水、透明、封片。各步驟間用PBS洗滌5 min/次，共3次。細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。采用HPLAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。在400倍視野下選擇圖像，分析平均光密度值(AOD)。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組未出現(xiàn)癲癇發(fā)作，戊四氮致癇組可見點(diǎn)頭、面部抽動(dòng)、前肢陣攣及全身陣攣、跌倒等表現(xiàn)，氯喹干預(yù)組癲癇發(fā)作程度較戊四氮致癇組減輕。

2.2 各組腦組織內(nèi)mGluR5蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 對(duì)照組、戊四氮致癇組、氯喹干預(yù)組mGluR5相對(duì)表達(dá)量分別為1.367±0.076、1.895±0.043、1.564±0.056，三組比較，P<0.05；與戊四氮致癇組比較，對(duì)照組及氯喹干預(yù)組mGluR5水平低(P均<0.05)，對(duì)照組與氯喹干預(yù)組比較，P﹥0.05。見圖1。

注：N:對(duì)照組；P：戊四氮致癇組；C：氯喹干預(yù)組。

圖1 各組腦組織內(nèi)mGluR5蛋白的相對(duì)表達(dá)量(Western blotting法)

2.3 各組腦組織內(nèi)mGluR1蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較 mGluR1以細(xì)胞質(zhì)染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。圖像分析結(jié)果顯示mGluR1陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在海馬區(qū)。對(duì)照組、戊四氮致癇組、氯喹干預(yù)組mGluR1相對(duì)表達(dá)量分別為0.082 7±0.012 1、0.110 6±0.017 2、0.091 7±0.014 7。三組比較，P=0.000；戊四氮組高于對(duì)照組及氯喹干預(yù)組(P均<0.05)。對(duì)照組與氯喹干預(yù)組比較，P>0.05。

3 討論

Glu受體可借由間接代謝過程進(jìn)行活化，該受體可與Glu結(jié)合，具有興奮性神經(jīng)傳遞作用。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，癲癇狀態(tài)下Glu蓄積，由于再攝取障礙，激活Glu受體，神經(jīng)元異常放電，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[4～6]。Ⅰ組mGluR主要通過與興奮性G蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶，經(jīng)過一系列生化反應(yīng)，刺激細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備的Ca2+釋放，I組mGluR激活后，影響離子通道的離子轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)揮作用[7]。在癲癇動(dòng)物模型及癲癇患者海馬區(qū)會(huì)出現(xiàn)Ⅰ組mGluR的表達(dá)增高[8]，提示其與癲癇的發(fā)生有密切關(guān)系。mGluR5及mGluR1是Ⅰ組mGluR的亞型，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，mGluR5及mGluR1的激活可提高神經(jīng)元興奮性，增強(qiáng)離子型Glu受體的功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)紊亂病變中均存在mGluR5的功能障礙，如焦慮癥、抑郁癥、癲癇、神經(jīng)性疼痛、脆性X染色體綜合征、帕金森病及藥物成癮所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂[9～11]，在抗藥的顳葉癲癇患者海馬神經(jīng)元中mGluR5的表達(dá)明顯增高，分析認(rèn)為mGluR5表達(dá)的增高可能是癲癇抽搐的結(jié)果，并且mGluR5的高表達(dá)可能有利于維持其海馬的興奮性。Deutsch等[12]研究發(fā)現(xiàn)，選擇mGluR5的拮抗劑用于一些神經(jīng)功能紊亂的病變中，結(jié)果證實(shí)，mGluR5的拮抗劑可緩解患者病情。人類顳葉癲癇海馬mGluR1表達(dá)增高，能夠增加海馬癲癇發(fā)作易感性，遺傳性癲癇與mGluR1基因異常表達(dá)有關(guān)，抗藥性癲癇患者海馬神經(jīng)元mGluR1表達(dá)明顯增加[13～15]。綜上認(rèn)為，Ⅰ組mGluR可作為癲癇的治療靶點(diǎn)。

氯喹最初用于瘧疾的治療，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)氯喹的認(rèn)識(shí)不斷提升，目前，氯喹可用于多種疾病的治療，主要用于艾滋病病毒復(fù)制的防治。其通過干擾DNA復(fù)制、抑制蛋白質(zhì)合成發(fā)揮作用，還可抑制腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制一些病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[16～18]，且價(jià)格低廉，相對(duì)耐藥性好。本研究結(jié)果顯示，戊四氮可誘導(dǎo)試驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作，使腦組織內(nèi)mGluR5及mGluR1興奮性增高，表達(dá)增強(qiáng)，應(yīng)用氯喹干預(yù)后，mGluR5及mGluR1表達(dá)降低，大鼠癲癇發(fā)作程度減弱。提示氯喹可能通過抑制癲癇大鼠腦內(nèi)mGluR5及mGluR1的表達(dá)發(fā)揮抗癲癇作用。氯喹可作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，但是其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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高平(E-mail: wxh_2005@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.014

R544.1

A

1002-266X(2017)13-0049-03

2017-02-09)