越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的改善作用及機制

李亞巍，梁承武，金瑛，昌盛(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

·基礎研究·

越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的改善作用及機制

李亞巍，梁承武，金瑛，昌盛
(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

目的 探討越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶能力的改善作用，并初步探討其作用機制。方法 雄性KM種小鼠60只，隨機分為6組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量[400 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷中劑量[200 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷低劑量[100 mg/(kg·d)]組。空白對照組和模型對照組每天灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d；陽性對照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說明給予相應劑量藥液，每天定時灌胃給藥1次。給藥的同時，除空白對照組外，其余各組每天皮下注射D-半乳糖(1.25 g/kg)。連續給藥6周，建立衰老(學習記憶障礙)小鼠模型。末次給藥2 h后，進行跳臺試驗訓練檢測各組學習記憶能力。測試完畢，斷頭處死小鼠，采用化學比色法檢測小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫印跡法檢測小鼠海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達量。結果 與空白對照組比較，模型對照組小鼠跳臺錯誤次數增多，潛伏期縮短，且小鼠海馬組織AChE活性升高，SOD活性降低、MDA含量升高(P均<0.01)；與模型對照組比較，越橘花色苷各劑量組能夠延長小鼠跳臺潛伏期、減少5 min內出現的錯誤次數(P均<0.01)，且可以降低小鼠海馬組織AChE活性(P均<0.05)，升高SOD活性,降低MDA含量(P<0.01)；越橘花色苷高劑量組與陽性對照組比較，P均﹥0.05。免疫印跡結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低(P均<0.01)。與模型對照組比較，越橘花色苷中劑量組和高劑量組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對表達量下降(P均<0.01)，Bcl-2蛋白相對表達量升高(P均<0.01)。陽性對照組、越橘花色苷高劑量和越橘花色苷中劑量組比較，P均﹥0.05。結論 越橘花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力具有一定的改善作用，其作用機制可能與改善小鼠腦內氧化應激水平，增強Bcl-2的表達及抑制cleaved Caspase-3的表達相關。

學習記憶障礙；衰老；越橘花色苷；D-半乳糖；小鼠

越橘，又稱藍漿果、藍莓，為杜鵑花科越橘常綠灌木，全世界廣泛分布[1，2]。越橘果實味道酸甜可口，營養豐富，除了含有糖、氨基酸、維生素、膳食纖維等常規營養物質外，還含有豐富的對人體具有良好保健作用的多酚類物質——花色苷。據報道，越橘是目前花色苷含量最高的水果[3]。越橘花色苷是一種天然的營養物質，具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、促進視紅素再合成、延緩衰老等多重功效，且對人體沒有任何不良作用[4～6]。當前國內外對越橘花色苷在諸如抗氧化、清除自由基、抗癌等方面已有詳細報道[7，8]，但是，針對越橘花色苷對學習記憶能力影響的研究還非常少。因此，為探討越橘花色苷的益智健腦作用，2015年12月～2016年10月，本研究以D-半乳糖建立衰老(學習記憶障礙)小鼠模型，觀察越橘花色苷對模型小鼠學習記憶障礙的影響，并探討其作用機制，為越橘花色苷的進一步研究開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年KM種小鼠80只，雄性，體質量18～20 g，購于吉林大學基礎醫學院醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-吉2013-0001。動物適應性喂養1周后開始試驗，室溫18～28 ℃，相對濕度62%～80%。長白山野生越橘為8月份采收，于-80 ℃冰箱中保存備用，按參考文獻[9]方法，提取越橘花色苷；腦復康(吡拉西坦)購自吉林雙藥藥業集團有限公司；D-半乳糖購自上海國藥集團化學試劑有限公司；乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Caspase-3抗體購自美國Santa Cruza公司，其他試劑均為國產分析純。550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可見分光光度計購自上海UNICO儀器有限公司；TGL-16G臺式高速離心機購自上海安亭科學儀器廠；MTN-658自動生化分析儀購自長春市曼特諾醫療器械有限公司；DT-200型小鼠跳臺測試儀購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 小鼠學習記憶障礙模型的建立及分組 首先，將小鼠于實驗室飼養7 d以適應環境，然后經跳臺法篩選，即將小鼠置于跳臺裝置，施以24 V電壓，將過度敏感小鼠和極不敏感小鼠淘汰，篩選出活躍、對電擊反應敏感、逃避反應迅速的合格小鼠60只，隨機分為6組：空白對照組、模型對照組、陽性對照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量組[400 mg/(kg·d)]、越橘花色苷中劑量組[200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷低劑量組[100 mg/(kg·d)]，每組10只。空白對照組和模型對照組每天灌胃給予等體積的生理鹽水，1次/d；陽性對照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說明每天灌胃給予相應劑量的藥液，1次/d。給藥的同時，除了空白對照組外，其余各組小鼠每天頸背部皮下注射D-半乳糖1.25 g/kg，連續6周，建立D-半乳糖致學習記憶障礙小鼠模型[10，11]。

1.3 小鼠學習記憶功能的檢測 采用跳臺試驗。末次給藥2 h后，對小鼠進行跳臺試驗訓練。首先將各組動物放入跳臺箱適應3 min，隨后將小鼠放于安全平臺上，同時通以24 V交流電，記錄各組小鼠5 min內跳下平臺受電擊的次數(即錯誤次數)和第1次跳下平臺的潛伏期。24 h后重復測試，直接將小鼠放于安全臺上并通電，記錄小鼠5 min內出現的錯誤次數和首次跳下平臺的潛伏期。

1.4 海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量的測定 跳臺試驗結束后，立即對小鼠進行麻醉，斷頭處死小鼠，置于冰上迅速分離海馬與皮層，于冰冷生理鹽水中進行勻漿，制成10%腦組織勻漿液，并用冷凍離心機在-4 ℃條件下3 000 r/min低溫離心15 min，吸取上清液，-80 ℃保存備用，根據試劑盒說明書進行操作，采用化學比色法分別檢測各組小鼠海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量。

1.5 海馬組織中Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達的檢測 采用免疫印跡試驗。跳臺試驗結束后，斷頭處死小鼠，置于冰上迅速分離海馬，0.25%胰酶消化，收集細胞后以1 000 r/min離心10 min，以PBS洗2次，用PIPA細胞裂解液置冰浴裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，收集上清。經BCA法進行蛋白定量后，取等量樣品以12% SDS-PAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，Bcl-2和Caspase-3抗體(濃度1∶100)孵育過夜，再以過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL顯影,化學發光成像系統檢測。以目標蛋白與內標的積分吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠跳臺潛伏期及跳臺錯誤次數比較 見表1。模型對照組與空白對照組跳臺潛伏期和跳臺錯誤次數比較，P均<0.01，提示模型制作成功。

表1 各組小鼠跳臺潛伏期及跳臺錯誤次數比較

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組海馬組織AChE、SOD活性和MDA含量比較 見表2。模型對照組與空白對照組各指標比較，P均<0.01。

表2 各組AChE、SOD活性和MDA含量比較

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對表達量比較 空白對照組、模型對照組、陽性對照組、越橘花色苷低劑量組、越橘花色苷中劑量組、越橘花色苷高劑量海馬組織Bcl-2蛋白相對表達量分別為1.42±0.08、0.76±0.08、1.24±0.05、1.08±0.10、1.29±0.03，cleaved Caspase-3分別為0.51±0.03、0.97±0.05、0.65±0.07、0.86±0.08，0.62±0.01。與空白對照組相比，模型對照組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低(P均<0.01)；與模型對照組比較，越橘花色苷中劑量組和高劑量組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白相對表達量降低，Bcl-2 蛋白相對表達量升高(P均<0.01)。越橘花色苷高劑量和中劑量組與陽性對照組比較，P均﹥0.05。

3 討論

衰老是生命發生發展過程中的一個必經階段，主要表現為機體對環境的適應能力逐漸減弱甚至喪失，出現多器官、組織功能的衰退[12]。阿爾茨海默病(AD)，常被稱為老年性癡呆，是嚴重影響老年人身心健康的主要疾病，近年發病率逐年增高。AD為一種進行性神經退行性疾病，以記憶力減退、認知功能障礙為主要臨床癥狀，以大腦組織神經元纖維纏結、中老年斑沉積為主要病理改變，發病機制尚不明確，目前臨床仍無良好的防治藥物[13，14]。研究衰老和癡呆的動物模型很多，給小鼠注射D-半乳糖致衰老模型是根據衰老的代謝學說建立的一種常見的亞急性衰老模型，具備造模時間短、操作簡單、重現性良好等優勢，已成為國內外公認的模擬衰老動物模型的方法[15]。

跳臺試驗是一種常見的測試小型動物學習記憶能力的行為學檢測方法[16]，本研究結果表明，D-半乳糖能夠明顯抑制小鼠在新環境下的自發活動和探究能力，使小鼠的學習記憶功能明顯減退，而越橘花色苷能夠顯著改善小鼠的學習記憶障礙情況，表現為小鼠的跳臺錯誤次數顯著減少，潛伏期明顯延長。提示越橘花色苷能夠改善D-半乳糖致衰老小鼠的學習記憶能力。

AD的發病機制目前尚未完全闡明，“膽堿能學說”和“Aβ級聯學說”是目前國內外普遍公認的發病學說。“膽堿能學說”認為，AD患者體內的AChE活性較正常人顯著升高，可以大量水解ACh，導致中樞ACh含量明顯下降，從而影響神經遞質的傳遞，出現學習記憶障礙。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織AChE活性明顯升高，給予越橘花色苷后，能夠顯著降低D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織AChE活性。提示越橘花色苷可能通過調節AchE活性發揮改善學習記憶的作用。

“Aβ級聯學說”認為，AD發生發展過程中，AD患者腦組織中異常沉積的Aβ蛋白會引起一系列的細胞級聯反應，其中包括氧化應激損傷，這將直接或間接損傷膽堿能神經元細胞，造成學習記憶能力受損。而SOD和MDA是反映機體氧化還原狀態的主要標志物。SOD是機體的一種內源性抗氧化酶，其活性降低能夠導致腦部氧化應激損傷；MDA作為一種重要的脂質過氧化反應產物，其異常增加能夠間接反映體內自由基的受損情況。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，給予越橘花色苷后，能夠明顯升高D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織SOD活性、降低MDA含量。提示越橘花色苷可以通過抗氧化功能改善學習記憶功能，延緩機體衰老。

Bcl-2基因家族及其相關蛋白是最早發現與凋亡有關的基因，也是當前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族。Bcl-2的過度表達可以有效抑制細胞凋亡。 Caspases家族則是近年發現的在細胞凋亡過程中發揮關鍵作用的執行蛋白酶，它通常以無活性前體的形式存在于細胞中，當細胞進入凋亡時才被激活，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的激活標志著凋亡進入不可逆階段。因此，檢測cleaved Caspase-3的變化能夠準確地反映腦內神經元的凋亡情況。本研究結果顯示，與空白對照組相比，模型對照組cleaved Caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2表達降低。給予越橘花色苷后，各組cleaved Caspase-3蛋白表達均較模型對照組降低，Bcl-2蛋白表達隨著越橘花色苷濃度的升高呈現升高趨勢。提示越橘花色苷改善小鼠學習記憶障礙的作用機制可能與增強Bcl-2的表達及抑制cleaved Caspase-3的表達有關。

綜上所述，越橘花色苷具有改善D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶障礙的能力，其作用機制可能與改善小鼠腦內氧化應激水平，增強Bcl-2的表達及抑制cleaved Casepase-3的表達相關。

[1] 徐璐，鄭建仙.歐洲越橘花色苷的研究概況[J].中國食品添加劑，2005，21(4)：43-64.

[2] 李穎暢，孟憲軍.藍莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究[J].營養學報，2008，30(4)：427-429.

[3] Tiwari BK, O′Donnell CP, Patras A, et al. Anthocyanins and color degradation in ozonated grape juice[J]. Food Chem Toxicol， 2009，47(11):2824-2829.

[4] 盧艷花，鄒彥平，秦會玲，等.歐洲越桔和篤斯越桔體外抗氧化活性比較[J].中草藥，2004，35(6)：674-679.

[5] 孫志健，張燕，陳芳，等.對藍莓產業化發展的思考[J].食品工業科技，2005，26(12)：183-184.

[6] Weiguang Y, Dalin L, Lidan X, et al. Association of OX40L polymorphisms with sporadic breast cancer in northeast Chinese Han population[J]. PLoS One, 2012,7(8):e41277.

[7] Mazza G, Kay CD, Cottrell T, et al. Absorption of anthocyanins from blueberries and serum antioxidantstatus in human subjects[J]. J Agric Food Chem, 2002,50(26):7731-7737.

[8] Kirca M, Kleinbongard P, Soetkamp D, et al. Interaction between connexin 43 and nitric oxide synthase in mice heart mitochondria[J]. J Cell Mol Med, 2015,19(4):815-825.

[9] 朱文赫,徐俊杰,張巍,等.長白山篤斯越橘中花色苷不同提取工藝的研究[J].食品研究與開發，2012，33(4)：59-62.

[10] Zhu L, Zhang L, Zhan L， et al. The effects of Zibu Piyin Recipe components on scopolamine-induced learning and memory impairment in the mouse[J]. J Ethnopharmacol, 2014,151(1):576-582.

[11] 布秀娟，劉暢，梁啟超．活血益智片對小鼠學習記憶障礙和血管性癡呆模型的影響[J]．遼寧中醫藥大學學報，2012，14(4):236-238

[12] Ikeda E, Shiba K, Mori H, et al．Reduction of vesicular acetylcholine transporter in beta-amyloid protein-infused rats with memory impairment[J]. Nucl Med Commun, 2000,21(10):933-937.

[13] Hartman RE, Izumi Y, Bales KR， et al．Treatment with an amyloid-beta antibody ameliorates plaque load, learning deficits, and hippocampal long-term potentiation in a mouse model of Alzheimer′s disease[J]. J Neurosci, 2005,25(26):6213-6220.

[14] 邵麗，葛許華，耿德勤，等．亞急性衰老動物模型的建立及機制[J]．中風與神經疾病雜志，2012，29(6):499-501.

[15] Kunisawa K, Nakashima N, Nagao M, et al． Betaine prevents homocysteine-induced memory impairment via matrixmetalloproteinase-9 in the frontal cortex[J]. Behav Brain Res, 2015,292:36-43.

[16] Van der Linden M． The myth of Alzheimer disease[J]. Rev Med Suisse， 2013，9(371)：244-245．

國家自然科學基金資助項目(21102055)；吉林市科技局杰出青年人才培養計劃(20156429)。

昌盛(E-mail：lyw135@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.010

R338

A

1002-266X(2017)13-0036-04

2017-01-12)