石榴皮總黃酮對高糖環境下人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用及機制

張蕾，張必嘏，郭麗萍(上海市第一人民醫院寶山分院，上海00940；上海交通大學醫學院附屬第三醫院)

石榴皮總黃酮對高糖環境下人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用及機制

張蕾1，張必嘏1，郭麗萍2
(1上海市第一人民醫院寶山分院，上海200940；2上海交通大學醫學院附屬第三醫院)

目的 探討石榴皮總黃酮對高糖環境下人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用及機制。方法 以0、5、10、20、40、80、160 mmol/L葡萄糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷后，采用MTT法檢測細胞的增殖活力。將對數生長期細胞分成空白組、模型組、陽性對照組、高濃度組、中濃度組、低濃度組。除了空白組外，其余均添加一定量葡萄糖使其終濃度為40 mmol/L，隨后陽性對照組加入1×10-5mmol/L氨基胍50 μL，高、中、低濃度組分別加入1×10-4mmol/L、1×10-5mmol/L、1×10-6mmol/L石榴皮總黃酮，各50 μL，培養48 h，觀察人臍靜脈內皮細胞的形態， MTT法檢測細胞增殖活力、碘化丙啶法檢測細胞周期，并檢測細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、NO、超氧化物歧化酶(SOD)含量。結果 與不加葡萄糖比較，含有≥40 mmol/L葡萄糖培養基培養的人臍靜脈內皮細胞吸光度值降低(P<0.05或<0.01)。與空白組比較，除高濃度組外，其余組吸光度值均降低(P<0.05或<0.01)；與模型組比較，其余組吸光度值均升高(P<0.05或<0.01)。40 mmol/L葡萄糖可使細胞周期阻滯于G0～G1期，而隨著石榴皮總黃酮濃度的增加，可有效促進細胞由G0～G1期向S期轉化，但對G2～M期無影響。與空白組比較，除高濃度組外，其余組細胞上清液中LDH、ICAM-1水平升高，SOD、NO水平降低(P<0.05或<0.01);與模型組比較，陽性對照組、高濃度組、中濃度組細胞上清液中LDH、ICAM-1水平降低，SOD、NO水平升高(P<0.05或<0.01)，低濃度組LDH水平降低(P<0.01)。結論 石榴皮總黃酮可明顯減輕高糖環境下人臍靜脈內皮細胞損傷程度，可促使細胞由G0～G1期進入S期，促進細胞增殖，機制可能與其降低黏附分子表達，提高SOD及NO水平有關。

人臍靜脈內皮細胞；細胞損傷；石榴皮黃酮；高糖環境

隨著人們生活方式及飲食結構改變，糖尿病及其相關血管并發癥的發病率較以往顯著增加。目前研究發現，血管內皮細胞功能紊亂是其主要的發病因素[1]；此外，由于大部分2型糖尿病患者長期受糖毒性、高血壓等問題困擾，以至于目前的治療效果不理想。長期服用化學藥物又對患者生理及心理均造成一定負擔[2]。因此，采取一種更為安全、有效的天然藥物是目前研究及治療的趨勢。以往研究發現，中藥提取物如楊梅素[2]、番茄紅素[3]等黃酮類物質有助于減輕血管內皮細胞損傷，其他黃酮類中藥提取物是否也具有相似功能值得深入研究。研究證實，石榴皮中含有大量的黃酮類物質，主要包括黃酮類、黃酮醇類、鞣質類、生物堿類、有機酸類等，其黃酮類成分在抗氧化和清除自由基能力上具有顯著成效[4]，但其在糖尿病患者治療中的應用報道較少。2016年3～7月，本文通過構建高糖誘導的內皮細胞損傷模型，并給予不同濃度石榴皮總黃酮治療，以便更好評估其在臨床治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶、膠原酶均購自Gibco公司，DMSO、氨基胍、碘化丙啶購自Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)及NO試劑盒購自南京聚力生物醫學工程研究所；細胞間黏附分子1(ICAM-1)試劑盒購自ABI公司；石榴皮總黃酮實驗室自制；JHBE-50 閃式提取器購自河南金鼎科技發展有限公司；ELite EsP 流式細胞儀購自Coulter公司;酶標儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 石榴皮總黃酮的提取 取石榴皮粉末500 g，精密稱定，采用閃式提取法提取，加入10倍量的80%乙醇溶液，提取2次，每次2 min，合并兩次醇提液，回收乙醇至無醇味，水溶液加入石油醚萃取2次，每次50 mL，棄去石油醚層，水溶液濃縮，干燥。參考文獻[5]對石榴皮總黃酮的含量進行測定。

1.3 人臍靜脈內皮細胞培養及分組 參照文獻[6]方法，取健康產婦分娩時無菌條件下的胎兒臍帶，以PBS沖洗殘留血后，加入0.1% Ⅰ型膠原酶，37 ℃ 消化15 min，再以含有20% FBS的RPMI-1640培養基沖洗靜脈，收集沖洗液，1 000 r/min離心處理5 min，棄上清液，用含有相同的完全培養基重懸細胞，接種于T25細胞培養瓶中，接種密度1×106/mL，每隔2～3 d換液1次。待細胞生長至對數生長期時，開始后續實驗。

1.4 不同濃度葡萄糖作用后人臍靜脈內皮細胞增殖活力的檢測 采用MTT法。取對數生長期細胞，經胰酶消化后，用完全培養基重懸細胞并按1 000個/孔接種至96孔板中，添加葡萄糖使其終濃度為0、5、10、20、40、80、160 mmol/L，放入37 ℃、5% CO2環境中培養2～3 d。棄去培養液，加入 MTT(5 g/L) 20 μL，37 ℃培養4 h，加入 DMSO 100 μL緩慢振蕩10 min，A490 nm波長下檢測吸光度值。

1.5 石榴皮總黃酮作用后人臍靜脈內皮細胞增殖活力的檢測 取對數生長期細胞，經胰酶消化后，將細胞分成空白組、模型組、陽性對照組、高濃度組、中濃度組、低濃度組。用完全培養基重懸細胞并按1 000個/孔接種至96孔板中，除空白組外，其余均添加一定量葡萄糖使其終濃度為40 mmol/L，隨后陽性對照組加入1×10-5mmol/L氨基胍50 μL，高、中、低濃度組分別加入1×10-4mmol/L、1×10-5mmol/L、1×10-6mmol/L石榴皮總黃酮，各50 μL,然后放入37 ℃、5% CO2中培養2～3 d。在倒置相差顯微鏡下，觀察人臍靜脈內皮細胞的形態；棄去培養液，加入MTT(5 g/L)20 μL，其余步驟同1.4。

1.6 細胞周期檢測 采用碘化丙啶法。以上各組細胞分別培養48 h時后，取0.25%胰酶消化，離心收集細胞，培養基重懸細胞后使各樣板細胞數為1×106/L，并加入生理鹽水2 mL，離心，用 D-Hank′s 200 μL重懸，加入預冷的70%乙醇固定細胞，1 500 r/min離心10 min，加入生理鹽水1 mL 重懸后再次離心，加入碘化丙啶500 μL,4 ℃ 放置15 min，將待測樣品加入流式細胞儀中，選擇488 nm波長處檢測細胞周期。每個樣品含有5 000～10 000個細胞，并采用multicycle DNA分析軟件處理。

1.7 人臍靜脈內皮細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、SOD、ICAM-1、NO水平檢測 收集培養48 h后的空白組、模型組、高濃度組、中濃度組及低濃度組細胞上清液，并參照試劑盒說明書，采用比色法在440 nm處測定吸光度值，并計算LDH釋放量。采用黃嘌呤氧化酶法在550 nm測定吸光度值，并計算SOD水平。采用酶聯免疫吸附法在450 nm測定吸光度值，并計算ICAM-1水平。采用比色法在550 nm測定吸光度值，并計算NO水平。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖作用后人臍靜脈內皮細胞的增殖活動 含0、5、10、20、40、80、160 mmol/L葡萄糖的完全培養基培養人臍靜脈內皮細胞，在A490 nm測定的吸光度值分別為0.276±0.044、0.314±0.047、0.281±0.035、0.241±0.038、0.164±0.033、0.134±0.038、0.043±0.035，與不加葡萄糖比較，含有≥40 mmol/L葡萄糖培養基培養的人臍靜脈內皮細胞吸光度值降低(P<0.05或<0.01)。

2.2 石榴皮總黃酮對高糖環境下臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用 空白組、模型組、陽性對照組、高濃度組、中濃度組、低濃度組吸光度值分別為0.276±0.044、0.164±0.033、0.225±0.035、0.254±0.037、0.231±0.039、0.186±0.041，與空白組比較，除高濃度組外，其余組吸光度值均降低(P<0.05或<0.01)；與模型組比較，其余組吸光度值均升高(P<0.05或<0.01)

2.3 石榴皮總黃酮對高糖所致人臍靜脈內皮細胞形態學的影響 倒置相差顯微鏡下，空白組細胞生長狀態良好，貼壁較牢，細胞間連接緊密,呈多角形或短梭形，大小均勻，邊界清楚，呈單層“鋪路石”樣排列；模型組細胞收縮、變圓，胞體變小，細胞間隙增寬，胞核模糊，細胞邊界模糊，細胞間仍彼此相連，有細胞脫落現象；陽性對照組與空白組的細胞形態無顯著差別；低劑量組細胞均發生收縮、變圓、細胞間隙增寬現象；中劑量組細胞邊界尚清楚，形狀規則，細胞間彼此相連，很少有細胞脫落現象；高劑量組與空白組細胞形態無顯著差別。

2.4 石榴皮總黃酮對人臍靜脈內皮細胞細胞周期的影響 空白組、模型組、陽性對照組、高濃度組、中濃度組、低濃度組G0～G1期細胞百分比分別為47.1%、61.2%、49.5%、52.4%、56.8%，S期細胞百分比分別為27.8%、12.6%、27.6%、23.4%、18.5%，G2～M期細胞百分比分別為25.1%、26.2%、22.9%、24.2%、27.4%。各組G0～G1期及S期細胞百分比比較，P均<0.05。40 mmol/L葡萄糖可使細胞周期阻滯于G0～G1期，而隨著石榴皮總黃酮濃度的增加，可有效促進細胞由G0～G1期向S期轉化，但對G2～M期無影響。

2.5 各組細胞上清液中LDH、ICAM-1、SOD、NO水平比較 見表1。

表1 各組細胞上清液中LDH、SOD、ICAM-1、NO水平比較

注：與空白組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組對比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

血管內皮細胞是覆蓋在血管內膜表面，并參與血液循環的一類重要細胞。其通過釋放生物活性物質，如NO等調節血管收縮及舒張，通過調控細胞間黏附分子如ICAM-1的表達等來調控炎癥的發生[6,7]；一旦內皮細胞出現損傷，即可引起ICAM-1等分子的高表達，而后者對白細胞具有極強的吸附作用。當白細胞黏附于血管壁時將引起自由基以及炎癥細胞因子釋放，并進一步加劇內皮細胞損傷。石榴皮藥用價值極高，其中含有的有效成分之一即是黃酮類物質。研究[8]證實,黃酮類物質具有抗細胞凋亡、抗氧化及消除氧自由基作用，且長期服用含黃酮類物質可改善內皮功能，降低血壓。但以往對于石榴皮總黃酮作用主要集中在缺氧所致的內皮細胞損傷模型中，缺少高糖引起的內皮細胞損傷模型。

本研究發現，人臍靜脈內皮細胞在40 mmol/L葡萄糖濃度下即可出現細胞損傷，同時在該濃度下對細胞滲透壓影響較小，且基本與文獻[9]報道相符，因此，本研究采用此濃度葡萄糖構建內皮細胞損傷模型。結果顯示，40 mmol/L葡萄糖對于細胞增殖具有明顯抑制作用，且細胞大多數處于G0～G1期。細胞周期中存在兩個限制點，分別為G0～G1期及G2～M期，當細胞增殖過程中出現DNA或紡垂體損失時，可使細胞停滯于以上兩期并進行適當修復，由此可見，高糖可能對細胞DNA造成損傷。研究發現，高糖環境下DNA鏈斷裂概率較高，且誘導細胞凋亡的發生[10]，但目前對于其詳細的致病機制及調控因素仍處于探索階段。本研究結果顯示，40 mmol/L葡萄糖可使細胞周期阻滯于G0～G1期，而隨著石榴皮總黃酮濃度的增加，可有效促進細胞由G0～G1期向S期轉化。與空白組比較，除高濃度組外，其余組吸光度值均降低；與模型組比較，其余組吸光度值均升高。提示石榴皮總黃酮可減輕人臍靜脈內皮細胞損傷程度，改善其細胞周期分布。

LDH 是內皮細胞損傷后的代謝產物，直接反映內皮細胞損傷的程度。本文結果顯示，高糖環境誘發細胞LDH升高，而石榴皮總黃酮抑制LDH 的釋放，減輕內皮細胞損傷。由于氧化應激反應是細胞內皮損傷的重要因素之一，而活性氧的相對含量增加對于促進糖尿病相關并發癥的發展具有直接作用。因此，提高SOD水平可有效清除超氧陰離子，從而起到保護作用。本研究結果證實，提高石榴皮總黃酮給藥劑量對于提高SOD水平有幫助。此外，NO作為血管擴張劑，其本身是活潑自由基，可與超氧陰離子快速結合生產過氧亞硝，而SOD高活性在減少超氧陰子濃度的同時，可使NO含量提高，從而增強舒張血管的作用。謝奇等[11]研究發現，石榴皮總黃酮提取物可緩解大鼠心衰癥狀，其作用機制可能是由于石榴皮總黃酮提高血管內SOD含量從而強化抗氧化作用，并通過內皮途經提高NO含量、抑制鈣內流。此外，細胞間黏附分子表達量的減少，對于改善內皮損傷也具有作用。以往研究[12～14]發現，減少ICAM-1表達量可使白細胞更難吸附于內皮細胞，從而減少自由基釋放及脫顆粒途經的啟動，從而避免了內皮細胞損傷進入惡性循環。本研究結果顯示，石榴皮總黃酮可使人臍靜脈內皮細胞ICAM-1含量降低，與文獻報道一致。提示其可能通過減少黏附因子表達，提高SOD及NO水平而減輕人臍靜脈內皮細胞損傷。

綜上所述，石榴皮總黃酮可明顯減輕高糖所致的人臍靜脈內皮細胞損傷，可促使細胞由G0～G1期進入S期，促進細胞增殖，減少黏附分子表達，提高SOD及NO水平，且改善程度具有明顯的劑量依賴性。

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Protective effect of total flavonoids of Pomegranate husk on injuries of human umbilical vein endothelial cells under high glucose

ZHANGLei1,ZHANGBixia,GUOLiping

(1BaoshanBranchofShanghaiFirstPeople'sHospital,Shanghai200940,China)

Objective To investigate the protective effect of total flavonoids of Pomegranate husk on injuries of human umbilical vein endothelial cells under high glucose.Methods The injuries of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were induced by 0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160 mmol/L glucose. MTT was used to detect the cell viability. The cells in the logarithmic phase were divided into the blank group, model group, positive control group, high concentration group, medium concentration group and low concentration group. In addition to the blank group, cells in the rest of the groups were added with a certain amount of glucose to the final concentration of 40 mmol/L, followed by the positive control group with 1×10-5mmol/L aminoguanidine 50 μL, high, medium and low concentration groups with 1×10-4, 1×10-5and 1×10-6mmol/L total flavonoids of Pomegranate husk (50 μL in each group), and they were all cultured for 48 h. We observed the morphology of human umbilical vein endothelial cells. MTT assay was used to detect cell viability. The cell clyce, the levels of lactate dehydrogenase (LDH), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), NO and superoxide dismutase (SOD) were measured by the propidium iodide method.Results The optical density (OD) of HUVECs treated with glucose (≥40 mmol/L) was decreased as compared with that of HUVECs without adding glucose (P<0.05 orP<0.01). Compared with the blank group, in addition to high concentration group, the OD in the other groups was decreased (P<0.05 orP<0.01). Compared with the model group, the OD of the other groups was increased (P<0.05 orP<0.01). Forty mmol/L glucose caused cell cycle arrest in G0-G1phase, and with the increase of flavonoids from Pomegranate husk, it effectively promoted the cell transformation from G0-G1 to S phase, but it had little effect on cells in the G2-M phase. Compared with the blank group, the levels of LDH and ICAM-1 were higher in the supernatant of the other groups except in the high concentration group, and the levels of SOD and NO were decreased. Compared with the model group, the levels of LDH and ICAM-1 in the supernatant of the positive control group, the high concentration group and the medium concentration group were decreased, the levels of SOD and NO were increased (P<0.05 orP<0.01), and the LDH level in the low concentration group was decreased (P<0.01).Conclusion Flavonoids from Pomegranate husk can significantly reduce the injuries of HUVECs under high glucose, promote the cell from G0-G1to S phase, and promote cell proliferation, which may be related with the reduction of expression of adhesion molecules, and the increase of SOD and NO.

human umbilical vein endothelial; cell injuries; flavonoids from Pomegranate husk; under high glucose

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題(20144Y0235)。

張蕾(1980-)，女，主治醫師，從事糖尿病腎病的臨床研究。E-mail：yynn150@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.008

R151.4

A

1002-266X(2017)13-0028-04

2017-01-11)