上皮性卵巢癌組織中FOXC1的表達變化及意義

黃玲，任琛琛，楊立，白楊，薛景戈，劉靈，李倩(鄭州大學第三附屬醫院,鄭州450052)

上皮性卵巢癌組織中FOXC1的表達變化及意義

黃玲，任琛琛，楊立，白楊，薛景戈，劉靈，李倩
(鄭州大學第三附屬醫院,鄭州450052)

目的 探討上皮性卵巢癌組織中叉頭框蛋白C1(FOXC1)的表達變化及意義。方法 選取良性上皮性卵巢瘤30例份、交界性上皮性卵巢瘤30例份、上皮性卵巢癌70例份，應用免疫組化SP法檢測組織FOXC1、上皮性黏鈣蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達水平,比較其三者與臨床病理參數的關系；隨訪患者3年，比較組織中FOXC1、E-cadherin和Vimentin表達陽性與陰性患者的3年累積生存率。結果 ①與良性上皮性卵巢瘤組織比較，上皮性卵巢癌組織中FOXC1、E-cadherin表達陽性率降低，Vimentin表達陽性率升高(P均<0.05)。②FOXC1陽性表達的卵巢癌組織中E-cadherin表達陽性率為28.6%(20/70)、Vimentin表達陽性率為15.7%(11/70)，FOXC1表達與E-cadherin表達呈正相關(r=0.446，P=0.000)，與Vimentin表達呈負相關(r=-0.295，P=0.014)。③上皮性卵巢癌組織中FOXC1蛋白表達與淋巴結轉移、二元論分型、兩組分級有關,E-cadherin、Vimentin蛋白表達與淋巴結轉移、臨床分期、二元論分型、兩級分級有關(P均<0.05)。④上皮性卵巢癌組織中FOXC1、E-cadherin陽性患者3年累積生存率分別為82.1%、80.6%，高于FOXC1、E-cadherin陰性患者69.0%、69.2%，Vimemtin陽性患者3年累積生存率為70%，低于Vimemtin陰性患者80%(P均<0.05)。結論 上皮性卵巢癌組織中FOXC1的表達降低，其表達缺失介導了卵巢的上皮間質轉化，可能參與了卵巢癌的發生發展，并可評估其預后。

上皮性卵巢癌；叉頭框蛋白C1；上皮間質轉化；上皮性黏鈣蛋白；波形蛋白

腫瘤轉移、復發是一個多步驟、多環節的連續復雜動態過程，卵巢癌極易發生盆、腹腔內廣泛侵襲播散轉移。因此，如何更好地抑制卵巢癌細胞侵襲轉移成為卵巢癌基礎和臨床研究探索的重點及難點。上皮間質轉化(EMT)，即具有極性的上皮細胞失去極性，轉化成間質細胞，并獲得侵襲和轉移能力的過程[1]，是腫瘤發生的早期事件。EMT機制是上皮來源的腫瘤細胞獲得侵襲性的關鍵分子事件，在惡性腫瘤的發生發展和侵襲轉移中發揮重要作用[2]。上皮性黏鈣蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)是EMT相關蛋白[3～5]，Vimentin是間質細胞最主要的中間纖維，其表達升高是導致E-cadherin表達缺失的原因，同時會干擾E-cadherin介導的細胞黏附作用。轉錄因子叉頭框蛋白C1(FOXC1)作為叉頭框家族的一員,可能參與了EMT的發生。本研究采用免疫組化SP法，初步探討在卵巢病變組織中FOXC1與EMT相關蛋白在不同病理特征下的表達情況及其相關性，進一步判斷其在上皮性卵巢癌發生發展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2013年1月在鄭州大學第三附屬醫院手術切除的卵巢病變組織，并保存有石蠟包塊130例份，術后均經病理檢查明確診斷?；颊呔鶠榕裕渲猩掀ば月殉舶?0例，年齡32～79歲；交界性上皮性卵巢瘤30例，年齡20～65歲；良性上皮性卵巢瘤30例，年齡26～52歲。漿液性卵巢癌31例，黏液性卵巢癌15例，子宮內模樣卵巢癌12例，透明細胞癌6例,移行性細胞癌4例，癌肉瘤2例；兩級分級系統：低級別漿液性癌(LGSC)13例，高級別漿液性癌(HGSC)18例；二元論分型：Ⅰ型卵巢癌(包括低級別漿液性卵巢癌、黏液性癌、低級別子宮內膜樣卵巢癌、透明細胞癌以及移行細胞癌)32例，Ⅱ型卵巢癌(包括高級別漿液性卵巢癌、高級別子宮內膜樣卵巢癌以及癌肉瘤)38例?；颊呷〔那熬唇邮苓^放、化療等治療。

1.2 組織中FOXC1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達的檢測 采用免疫組化SP法。常規脫蠟和梯度乙醇水化處理，高溫加熱下抗原修復，封閉內源性過氧化物酶，封閉非特異性抗原，一抗室溫下孵育，二抗室溫下孵育，HRP孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片等。以PBS代替一抗作陰性對照，嚴格按說明書操作。FOXC1兔抗人多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，Vimentin兔抗人多克隆抗體購于上海生工生物工程有限公司，E-cadherin兔抗人多克隆抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司。通用型二步法免疫組化檢測試劑(PV9000)和濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9018)購于北京中杉金橋公司。

1.3 判定標準 FOXC1以細胞內出現棕黃色顆粒判為陽性。陽性對照細胞內出現棕黃色著色。E-cadherin陽性對照細胞質和細胞膜出現棕黃色顆粒，Vimentin陽性對照細胞質出現棕黃色顆粒。陰性對照片無棕黃色著色。按照半定量積分法判定結果：光鏡下，隨機觀察10個高倍鏡視野，按每高倍鏡視野陽性細胞百分比計分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；按染色強度計分：染色呈淡黃色者計為1分，呈黃色計為2分，呈棕黃色計為3分。兩種評分乘積即為陽性強度：>4為陽性，≤4為陰性。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法；相關性分析采用Pearson相關，求得Pearson列聯系數；應用 Kaplan-Meier生存曲線分析患者3年生存率，應用Log-rank檢驗生存率組間差異性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢病變組織中FOXC1、E-cadherin和Vimentin的表達比較 鏡下結果顯示：FOXC1主要表達在細胞核和細胞質，E-cadherin主要表達在細胞質和細胞膜，Vimentin主要表達在細胞質。在良性上皮性卵巢瘤、交界性上皮性卵巢瘤、上皮性卵巢癌組織中，FOXC1表達陽性率分別為76.0%(23/30)、46.0%(14/30)、40.0%(28/70)，E-cadherin表達陽性率分別為80.0%(24/30)、50.0%(15/30)、79.5%(31/70)，Vimentin表達陽性率分別為7.1%(2/30)、40.0%(12/30)、57.1%(40/70),3種組織間各指標比較差異均有統計學意義(χ2分別為11.467、11.010、22.071，P分別為0.003、0.004、0.000)。與良性上皮性卵巢瘤比較，上皮性卵巢癌組織中FOXC1、E-cadherin表達陽性率低,Vimentin表達陽性率高(χ2值分別為11.298、10.823、21.964,P分別為0.000、0.001、0.000)。

2.2 上皮性卵巢癌組織中FOXC1與E-cadherin和Vimemtin表達的相關性 FOXC1陽性表達的上皮性卵巢癌組織中E-cadherin表達陽性率為28.6%(20/70)、Vimentin表達陽性率為15.7%(11/70)，Pearson相關性分析結果顯示，FOXC1表達與E-cadherin表達呈正相關(r=0.446，P=0.000)，與Vimentin表達呈負相關(r=-0.295，P=0.014)。

2.3 上皮性卵巢癌組織中FOXC1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達與臨床病理參數的關系 見表1。FOXC1蛋白表達與年齡、臨床分期、腫瘤大小、組織分型無關，與淋巴結轉移、二元論分型、兩級分級有關(P均<0.05)。E-cadherin、Vimentin蛋白表達與年齡、腫瘤大小、組織分型無關，與臨床分期、淋巴結轉移、二元論分型、兩級分級有關(P均<0.05)。

表1 上皮性卵巢癌組織中FOXC1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達與臨床病理參數的關系[例(%)]

2.4 上皮性卵巢癌患者FOXC1、E-cadherin和Vimemtin蛋白表達陽性和陰性的3年累積生存率比較 見圖1。隨訪3年，上皮性卵巢癌患者FOXC1陽性28例，陰性42例；E-cadherin陽性31例，陰性39例；Vimemtin陽性40例，陰性30例。Kaplan-Meier存曲線顯示，FOXC1、E-cadherin陽性患者3年累積生存率為82.1%、80.6%，高于FOXC1、E-cadherin陰性患者69.0%、69.2%(FOXC1：χ2=7.712，P=0.05；E-cadherin：χ2=5.484，P=0.019)；Vimemtin陽性患者3年累積生存率為70%，低于Vimemtin陰性患者80%(Vimemtin：χ2=6.293，P=0.012)。

圖1 FOXC1、E-cadherin Vimemtin表達陽性與陰性者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

上皮性卵巢癌是病死率最高的婦科腫瘤，侵襲轉移仍是卵巢癌高病死率的主要原因[6]。EMT不僅是腫瘤發生發展、侵襲轉移的關鍵環節，相關研究表明，EMT還與腫瘤細胞化療耐藥性相關，因此，EMT及其調控因子是治療上皮性卵巢癌的重要靶標。我們對上皮性卵巢癌中FOXC1、E-cadherin及Vimentin的表達進行研究，有望在靶向標記物的精準研究方面取得突破與創新。

FOXC1蛋白廣泛存在于人體多種組織及器官中，其對組織器官的結構形成和功能發育起著重要作用[7]。近年研究表明，FOXC1的表達與乳腺癌、肝癌、鼻咽癌的發生發展有密切關系[8～11]，但在卵巢癌組織內的表達報道較少。先前有免疫組化法研究顯示，FOXC1蛋白在漿液性卵巢癌中的表達低于漿液性卵巢囊腺瘤及交界性漿液性囊腺瘤，且在漿液性卵巢癌中，FOXC1蛋白的陽性表達與組織分化、臨床分期、血CA125測定值呈負相關，提示FOXC1蛋白可能參與了卵巢腫瘤的生物學行為。Zhou等[12]研究發現，FOXC1 mRNA表達存在于多種人卵巢癌細胞系，可能作為TGF-β1的下游靶基因從而抑制癌細胞的增殖活性，提示FOXC1可能參與了卵巢癌的發生發展。本研究結果顯示，與良性上皮性卵巢瘤、交界性上皮性卵巢瘤相比，FOXC1蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達降低，且與卵巢癌淋巴結轉移、二元論分型、兩級分級有關，FOXC1陽性患者3年生存率亦高于FOXC1陰性患者，提示FOXC1蛋白表達缺失可能參與了卵巢癌的發生發展及侵襲轉移。

E-cadherin與腫瘤的分化和侵襲型以及細胞失去上皮細胞圓形和獲得侵襲性特征的過程密切相關。多項研究表明，E-cadherin是多種上皮性腫瘤發生發展、侵襲轉移的抑制因子[13,14]。本試驗中，在上皮性卵巢癌組織中E-cadherin的表達明顯低于良性上皮性卵巢瘤，在不同的臨床分期、淋巴結轉移、二元論不同分型、兩級分級間的表達陽性率差異有統計學意義，且E-cadherin陽性患者的生存率也高于E-cadherin陰性患者，表明E-cadherin對上皮性卵巢癌的發生發展有一定抑制作用。有報道發現，Vimentin在上皮性腫瘤中表達增加，與腫瘤的生長、侵襲和不良預后有關，被認為是癌細胞侵襲和轉移的必要條件[13，15]。本試驗中Vimentin在上皮性卵巢癌中的表達明顯高于良性上皮性卵巢腫瘤，與臨床分期、淋巴結轉移、二元論分型、兩級分級有關，且陰性患者生存率明顯高于陽性患者，提示Vimentin參與卵巢癌的發生發展，是癌組織向遠處浸潤轉移的一個重要因子。

間質細胞來源標志物Vimentin表達升高的同時出現上皮細胞來源標志物E-cadherin表達下降，提示EMT可能參與了上皮性卵巢癌的發生發展過程。本研究中，FOXC1高表達時，E-cadherin亦高表達而Vimentin低表達，同時由Kaplan-Meier生存曲線可知FOXC1、E-cadherin高表達和Vimentin低表達的患者生存率明顯高于FOXC1、E-cadherin低表達和Vimentin高表達患者，提示FOXC1可能在EMT過程中起一定作用，而E-cadherin及Vimentin的表達可能受到FOXC1的調節。本研究為上皮性卵巢癌的發生發展機制提供了依據，FOXC1有可能成為上皮性卵巢癌治療的新靶標。

此外，卵巢漿液性癌的兩級分級系統及卵巢癌的二元論模型理論已逐漸被廣泛采用，能夠更好地反映預后[16]。本研究結果顯示FOXC1在Ⅰ型卵巢癌和Ⅱ型卵巢癌、LGSC和HGSC的表達差異均有統計學意義，表明FOXC1在輔助卵巢癌的分級和分型中起一定作用，希望FOXC1在判斷疾病預后與提供治療指導中有一定意義。

綜上所述，FOXC1的缺失在卵巢癌進展中起重要作用。FOXC1可能通過介導EMT途徑，即調控E-cadherin和Vimentin表達抑制卵巢癌的發生發展。針對這一機制，通過恢復FOXC1在卵巢癌中的表達，可能對卵巢癌的發生發展起一定抑制作用，成為卵巢癌治療的新方向。

[1] Kalluri R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J]. J Clin Invest, 2009,119(6):1420-1428.

[2] Ansieau S, Caron de Fromentel C, Bastid J, et al. Role of the epithelial-mesenchymal transition during tumor progression[J]. Bull Cancer, 2010,97(1):7-15.

[3] Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell， 2009,139(5):871-890.

[4] Satelli A, Li S. Vimentin in cancer and its potential as a molecular target for cancer therapy[J]. Cell Mol Life Sci， 2011,68(18):3033-3046.

[5] Zeisberg M, Neilson EG. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions[J]. J Clin Invest， 2009，119(6):1429-1437.

[6] Lengyel E. Ovarian cancer development and metastasis[J]. Am J Pathol, 2010,177(3)：1053-1064.

[7] Myatt SS, Lam EW. The emerging roles of forkhead box (Fox) proteins in cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2007,7(11):847-859.

[8] Taube JH, Herschkowitz JI, Komurov K, et al. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2010，107(35)：15449-15454.

[9] Leontovich AA, Zhang S, Quatraro C, et al. Raf-1 oncogenic signaling is linked to activation of mesenchymal to epithelial transition pathway in metastatic breast cancer cells[J]. Int J Oncol， 2012,40(6):1858-1864.

[10] Xia L, Huang W, Tian D, et al. Overexpression of forkhead box C1 promotes tumor metastasis and indicates poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology， 2013,57(2):610-624.

[11] Ou-Yang L, Xiao SJ, Liu P, et al. Forkhead box C1 induces epithelial-mesenchymal transition and is a potential therapeutic target in nasopharyngeal carcinoma[J]. Mol Med Rep， 2015，12(6):8003-8009.

[11] Bartlett JM, Langdon SP, Scott WN, et al. Transforming growth factor-beta isoform expression in human ovarian tumours[J]. Eur J Cancer， 1997，33(14):2397-2403.

[12] Zhou Y, Kato H, Asanoma K, et al. Identification of FOXC1 as a TGF-beta1 responsive gene and its involvement in negative regulation of cell growth[J]. Genomics, 2002，80(5):465-472.

[13] Kurrey NK, Amit K, Bapat SA. Snail and Slug are major determinants of ovarian cancer invasiveness at the transcription level[J]. Gynecol Oncol, 2005,97(1):155-165.

[14] Davidson B, Holth A, Hellesylt E, et al. The clinical role of epithelial-mesenchymal transition and stem cell markers in advanced-stage ovarian serous carcinoma effusions[J]. Hum Pathol, 2015,46(1):1-8.

[15] 李祖茂.人波形蛋白中間絲的結構和功能及其與腫瘤的關系[J].醫學綜述,2009,15(17):2593-2595.

[16] Malpica A, Deavers MT, Lu K, et al. Grading ovarian serous carcinoma using a two-tier system[J]. Am J Surg Pathol, 2004,28(4):496-504.

Expression changes and significance of FOXC1 in human epithelial ovarian cancer

HUANGLing,RENChenchen,YANGLi,BAIYang,XUEJingge,LIULing,LIQian

(TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the expression changes and significance of fork box protein C1 (FOXC1) in human epithelial ovarian cancer (EOC). Methods The expression of FOXC1, E-cadherin and Vimentin in 30 cases of benign EOC tissues, 30 cases of borderline ECO tissues and 70 cases of ECO tissues was detected by immunohistochemical SP staining. The ovarian cancer patients were followed up for 3 years, and the 3-year cumulative survival rate was compared between ovarian cancer patients with positive and negative FOXC1, E-cadherin and Vimentin. Results ①The positive expression rates of FOXC1 and E-cadherin in the borderline ECO tissues were decreased, and the positive expression rate of Vimentin was increased as compared with those of the benigh ECO tissues (P<0.05). ② The positive expression rate of E-cadherin was 28.6% (20/70), the positive expression rate of Vimentin was 15.7% (11/70) in ovarian cancer tissues with positive expression of FOXC1, the expression of FOXC1 was positively correlated with the expression of E-cadherin (r=0.446,P=0.000), and was correlated with Vimentin expression (r=-0.295,P=0.014). ③ The expression of FOXC1 protein in EOC tissues was negatively correlated with lymph node metastasis, dualistic type and grading, and the protein expression of E-cadherin and Vimentin was correlated with lymph node metastasis, clinical classification, dualistic type and grading (allP<0.05). ④The 3-year cumulative survival rates of EOC patients with positive expression of FOXC1 and E-cadherin was 82.1% and 80.6%, respectively, which were higher than those in patients with negative expression of FOXC1 and E-cadherin (69.0% and 69.2%). The 3-year cumulative survival rates of EOC patients with positive expression of Vimentin was 70%, which was significantly lower than that in patients with negative Vimentin (80%) (allP<0.05). Conclusions The expression of FOXC1 is decreased in ovarian cancer tissues, and the loss expression of FOXC1 may be a role in the process of EMT. Meanwhile,FOXC1 expression may be involved in the occurrence and development of ovarian cancer and can be used as an indicator to evaluate prognosis.

epithelial ovarian carcinoma; fork box protein C1; epithelial-mesenchymal transition; E-cadherin; Vimentin

河南省科技廳科技攻關項目(162102310131);河南省科技廳科技攻關項目(142300410205)。

黃玲(1988-)，女，碩士研究生在讀，研究方向為婦科腫瘤。E-mail:415882664@qq.com

任琛琛(1968-)，女，博士，主任醫師，研究方向為婦科腫瘤。E-mail:renchenchen1106@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.004

R737. 31

A

1002-266X(2017)13-0013-04

2016-12-10)