大黃素對急性肝功能衰竭大鼠肝臟的保護作用機制

于盈 王鳳玲

大黃素對急性肝功能衰竭大鼠肝臟的保護作用機制

于盈 王鳳玲

目的 探討大黃素對急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝臟的保護作用機制。方法 將SD大鼠隨機分為健康對照組（6只）、ALF模型組（24只）和大黃素保護組（24只）。模型組、保護組用D-氨基半乳糖（D-Gal）建立ALF動物實驗?zāi)Ｐ停?2h后保護組按10mg/kg腹腔注射大黃素，2次/d；健康對照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。模型組、保護組在建模后24、72、120、168h隨機各取6只，取門靜脈血檢測肝功能指標(biāo)，取肝組織檢測其NF-κB水平，并進行比較分析。 結(jié)果 模型組造模后24、72、120h ALT水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）；保護組造模后24、72h ALT、AST水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）；造模后72h ALT、AST水平均為模型組高于保護組（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦均為模型組高于保護組（均P＜0.05）。HE染色見對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肝細胞大片壞死。造模后24、72、120h模型組、保護組NF-κB水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），兩組均在72h達到高峰；模型組造模后168h明顯高于對照組（P＜0.05）；造模后24、72、120、168h模型組均高于保護組（均P＜0.05）。 結(jié)論 大黃素對ALF大鼠的肝臟功能有保護作用，其機制可能與下調(diào)肝臟組織中NF-κB表達有關(guān)。

急性肝功能衰竭 大黃素 核因子-κB 大鼠

肝功能衰竭是由多種因素引起肝細胞合成、分泌以及生物轉(zhuǎn)化功能障礙的一種臨床綜合征，臨床表現(xiàn)以黃疸、肝性腦病、腹腔積液、凝血功能障礙等為主，肝臟組織學(xué)可觀察到廣泛的肝細胞壞死，壞死部位和范圍因病因、病程而異。肝功能衰竭包括急性、慢性、亞急性，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由肝臟功能急劇減退引起黃疸、凝血功能低下和肝性腦病等臨床表現(xiàn)的一種臨床綜合征。ALF發(fā)病急、病情進展迅速，當(dāng)前臨床上尚無有效的治療方法。大黃是臨床治療ALF應(yīng)用較為廣泛的一種中藥，其主要有效成分是大黃素，目前有研究證實大黃素具有多種活性作用，包括抗炎、肝功能保護、免疫調(diào)節(jié)等，亦有學(xué)者應(yīng)用大黃制劑防治肝癌、保護肝功能等[1－4]。NF-κB參與細胞增殖過程，其在肝臟組織中表達水平的變化能直接反映細胞增殖功能，因此可用來評價肝細胞的再生作用。故本研究通過建立ALF動物實驗?zāi)Ｐ筒⒉捎么簏S素治療，觀察肝組織病理學(xué)改變以及NF-κB表達、肝功能指標(biāo)的變化，以探討大黃素對肝臟功能保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 全自動生化分析儀（濟寧市潤煤工礦物資有限公司）；NF-κB-抗（廣州泰諾迪生物科技有限公司）；D-氨基半乳糖（D-Gal，重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室）；大黃素（廣州泰諾迪生物科技有限公司，批號：110756-200110）；NF-κB免疫組化試劑盒（廣州泰諾迪生物科技有限公司）。

1.2 動物分組 選取54只健康清潔級雄性SD大鼠（溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物合格證標(biāo)號：2010-04-12）54只，體重180～220g。按隨機數(shù)字表法分成健康對照組（6只）、ALF模型組（24只）和大黃素保護組（24只），3組大鼠均予相同喂養(yǎng)條件和飲食（溫度18～26℃，相對濕度5%～10%，噪聲＜85dB，每1h通氣換風(fēng)8～12次，飼喂量5g）。本研究符合動物實驗倫理學(xué)原則。

1.3 模型建立 所有大鼠造模前12h禁食、4h禁飲。稱取10g D-Gal溶于100ml 0.9%氯化鈉注射液中，用1mol/L NaOH將D-Gal溶液pH調(diào)至7.0，最終濃度調(diào)至10%。模型組、保護組按照1.25g/kg腹腔注射D-Gal溶液以制作ALF動物實驗?zāi)Ｐ停瑢φ战M注射等量0.9%氯化鈉溶液；造模12h后保護組按10mg/kg腹腔注射大黃素，2次/d。

1.4 檢測方法 對照組給藥24h后取靜脈血，遂將大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死并固定于解剖板上，用碘酒消毒后沿腹中線打開腹腔，取中央肝組織；模型組和保護組分別在給藥24、72、120、168h時取6只大鼠行腹腔麻醉、采集靜脈血、取肝組織，方法同上。靜脈血離心取上清液，－80℃冰箱保存；肝組織用甲醛固定，行病理及免疫組化檢測。（1）使用全自動生化分析儀檢測血清標(biāo)本中ALT、AST等肝功能指標(biāo)變化。（2）將甲醛固定的肝組織用石蠟包埋切片，HE染色，在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。將甲醛固定的肝組織脫水，嚴(yán)格按試劑盒說明檢測NF-κB水平。采用苯基丁酸（PBA）為陰性對照，以出現(xiàn)棕黃色細胞核為陽性。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析并測量肝組織平均光密度值（OD），OD=積分光密度/組織面積。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組別間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肝功能指標(biāo)變化 模型組造模后24、72、120h ALT水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）；保護組造模后24、72h ALT、AST水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）。造模后72h ALT、AST水平均為模型組高于保護組（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦為模型組高于保護組（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠不同時間點肝功能指標(biāo)變化

2.2 肝組織病理學(xué)改變 對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索，見圖1a；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肝細胞大片壞死，見圖1b。

圖1 大鼠肝組織病理學(xué)改變（a：對照組；b：模型組；HE染色，×400）

2.3 3組大鼠肝組織中NF-κB表達水平變化 對照組NF-κB不表達或有少量表達，NF-κB表達水平為（0.038±0.004）μg/ml。造模后24、72、120h模型組、保護組NF-κB水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），兩組均在72h達到高峰；模型組造模后168h NF-κB表達水平亦明顯高于對照組（P＜0.05）。造模后24、72、120、168h NF-κB表達水平為模型組高于保護組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠不同時間點肝組織中NF-κB表達水平比較（μg/ml）

3 討論

ALF最突出的表現(xiàn)是短時間內(nèi)肝細胞變性、壞死，炎癥因子明顯增加。由于ALF病情進展快且存在多種并發(fā)癥，因此其臨床治療難度大、預(yù)后差、病死率高。目前肝移植治療肝功能衰竭較為有效，但存在供體缺乏、費用昂貴等問題，故尚未推廣應(yīng)用[5－6]。因此，本研究探索一種中藥治療方法具有現(xiàn)實意義。

大黃素是大黃主要有效成分之一，屬于蒽醌類，近年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的相關(guān)研究較為廣泛。目前已證實大黃素具有保護肝細胞、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)作用；此外，大黃素對機體具有雙重調(diào)節(jié)作用，既能抑制T淋巴細胞增殖，減少膿毒血癥陽性率，減少炎癥因子過度釋放，又能抑制不同有絲分裂刺激脾細胞增殖。有學(xué)者應(yīng)用大黃素治療急性胰腺炎發(fā)現(xiàn)，連續(xù)治療1周的患者血淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等明顯下降，且明顯低于對照組，推測大黃素能抑制鈉離子、鉀離子，促進上皮細胞離子主動運轉(zhuǎn)，具有廣泛抗菌、抗病毒的效果[7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保護組血清ALT、AST水平明顯下降，且低于模型組，說明大黃素對肝功能有一定保護作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大黃素能抑制炎癥因子，減少內(nèi)毒素血癥，此外在清除氧自由基、減少炎癥遞質(zhì)方面也有明顯作用[8]。其他研究還發(fā)現(xiàn)注射大黃素后體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1等分泌明顯減少，認(rèn)為大黃素能減少肝細胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)[9]。本研究中大黃素對肝的保護作用可能與上述機制有關(guān)。由于細胞DNA合成與NF-κB密切相關(guān)[10]；NF-κB表達量能直接反映細胞增殖和復(fù)制活躍程度，是反映細胞增殖效應(yīng)的重要指標(biāo)[11-14]。本研究比較NF-κB表達發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，模型組大鼠肝組織中NF-κB水平明顯上升，造模后72h達高峰；而保護組大鼠肝組織中各時間點NF-κB水平均明顯低于模型組。這說明大黃素不僅對ALT、AST產(chǎn)生影響，還會影響NF-κB表達水平；提示大黃素可能通過抑制炎性細胞分泌和聚集以減少NF-κB表達，進而發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。

綜上所述，大黃素可能減少炎性細胞的釋放，抑制IKK細胞信號傳導(dǎo)通路，進而達到抑制肝細胞凋亡的效果，為肝細胞再生提供微環(huán)境。以上可能是大黃素治療ALF的機制，這為大黃素的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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Effects of emodin on liver function in rats with acute liver failure and its mechanism

YU Ying,WANG Fengling.Department of Infectious Diseases,Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000，China

Objective To investigate the effect of emodin on liver function in acute hepatic failure and its mechanism. Methods SD rats were randomly divided into three groups:healthy control group(n=6),acute liver failure(ALF)model group (n=24)and emodin treatment group (n=24).Acute liver failure was induced by intraperitoneal injection of D-galactosamine (D-Gal).Twelve hours after the model was established,the emodin group received intraperitoneal injection of 10mg/kg emodin twice daily.At 24,72,120 and 168h after modeling,6 rats were sacrificed in ALF group and emodin group.The portal vein blood samples were collected and hepatic function was examined.Liver tissue was fixed with 10%formalin,and the expression of NF-κB in liver tissue was detected by immunohistochemistry. Results After 24h of modeling,the levels of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in serum were significantly higher than those in healthy control group (P＜0.01),after 72h of modeling,the liver function of rats in ALF group was significantly higher than of emodin group at the same time point(P＜0.01),after 24h of modeling,the expression of NF-κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group(P＜0.01),reached the peak at 72h,then decreased after 120h.The expression of NF-κB in emodin group was significantly lower than that in ALF group at 72,120 and 168h after modeling(P＜0.01). Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats,which may be related to the down-regulation of NF-κB expression.

Acute liver failure Emodin NF-κB Rat

2017-01-03）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2017-21

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計劃項目（2010ZA118）；臺州市椒江區(qū)科技計劃項目（112070）

318000 臺州市立醫(yī)院感染內(nèi)科

于盈，E-mail：lhjyy@126.com