CYLD在胰腺癌組織中的表達變化及意義

姜維民，徐小永，李春民，楊捷，周昆明，呂偉，周丁華

(1中國人民解放軍火箭軍總醫院，北京 100088；2首都醫科大學附屬北京朝陽醫院)

CYLD在胰腺癌組織中的表達變化及意義

姜維民1，徐小永1，李春民2，楊捷1，周昆明1，呂偉1，周丁華1

(1中國人民解放軍火箭軍總醫院，北京 100088；2首都醫科大學附屬北京朝陽醫院)

目的 觀察胰腺癌組織中頭帕腫瘤綜合征蛋白(CYLD)的表達變化并探討其意義。方法 收集44例胰腺癌患者術后的癌組織和癌旁正常胰腺組織標本，采用免疫組化SP法檢測CYLD表達，并分析CYLD表達與胰腺癌患者臨床病理特征及預后的關系。結果 胰腺癌組織、癌旁正常胰腺組織中CYLD陽性表達率分別為45.45%(20/44)、75%(33/44),二者比較差異有統計學意義(P<0.01)。胰腺癌組織CYLD表達與胰腺癌患者的N分級、AJCC分期和組織分化程度有關(P均<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及CA199水平無關(P均>0.05)。CYLD表達與胰腺癌患者的生存時間有關(P<0.01)，CYLD低表達者中位生存時間為8.27個月(95%CI為5.61～10.88個月)，2年累積生存率為5.4%，而CYLD高表達者中位生存時間為16.72個月(95%CI為14.12～19.31個月),2年累積生存率為17%。Cox回歸分析提示CYLD為胰腺癌患者的獨立預后因子(RR=3.839，P<0.05)。結論 CYLD在胰腺癌組織中表達下調，其異常表達可能與胰腺癌發生發展有關，檢測其表達有助于患者預后判斷。

胰腺癌；頭帕腫瘤綜合征蛋白；免疫組織化學；臨床病理特征

胰腺癌是常見高度惡性的消化道腫瘤之一，近年來發病率逐年上升。2006～2010年，胰腺癌連續位居我國惡性腫瘤發病率的前10位[1]。由于發病隱匿且缺乏特異性臨床癥狀，早期診斷率低，且胰腺癌惡性度高，發展迅速，早期即可侵犯血管，因此患者的預后極差。目前，對早中期胰腺癌的治療仍以手術切除為主，輔以放化療等。晚期胰腺癌的治療手段較局限，急需新型靶向治療藥物。頭帕腫瘤綜合征蛋白(CYLD)是一種細胞內多功能去泛素化酶，其失活在腫瘤發生、發展過程中起重要的調節作用，而關于CYLD在胰腺癌組織中的表達研究較少。因此，我們采用免疫組化法檢測了44例胰腺癌患者癌組織中CYLD的表達，并分析CYLD表達與胰腺癌患者臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年1月～2014年2月于中國人民解放軍火箭軍總醫院(即前第二炮兵總醫院)肝膽外科接受手術治療的44例胰腺癌患者癌組織標本，患者男27例、女17例，年齡20～79歲、中位年齡61歲。患者術前均未進行化療、放療、介入等輔助治療，所有病例術后經病理醫師確診為胰腺癌，腫瘤的分化程度依據Edmondson-Steiner分級標準來確定，同時依據美國腫瘤研究聯合委員會(AJCC)2010發布的第七版分期標準進行分期。其中低分化13例，中分化14例，高分化17例；Ⅰ期10例，Ⅱ期20例，Ⅲ期5例,Ⅳ期9例。同時取距腫瘤邊緣5 cm的組織(經鏡檢證實未被腫瘤侵犯的正常組織)作為對照。患者術后定期隨訪，采用電話與來院相結合的方式，每3個月行腹部B超檢查一次，必要時行腹部CT檢查。

1.2 胰腺癌組織中CYLD表達檢測 采用免疫組化SP法，試劑為Sigma公司兔抗人CYLD抗體(1∶200)；免疫組化嚴格按照試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。由兩名互相獨立且對研究內容并不知情的病理醫師對免疫組織化學染色切片進行觀察評分。400倍放大視野下，隨機選取10個獨立區域進行觀察和細胞計數。用以下兩種方法對切片進行半定量評估：①陽性染色細胞比例評分：0分(無陽性染色細胞)；1分(陽性染色細胞比例<10%)；2分(陽性染色細胞比例<50%)；3分(陽性染色細胞比例>50%)。②染色強度評分：0分(無染色細胞)；1分(染色程度弱為淡黃色)；2分(染色程度中等為黃棕色)；3分(染色程度強為棕色)。染色評分采用以下公式進行計算：染色評分=陽性染色細胞比例評分×染色強度評分。應用上述方法評估每張切片的染色評分(分值分別為0、1、2、3、4、6、9分)。根據Log-Rank檢驗結果確定最優截止值：≥4分為CYLD高表達，≤3分為CYLD低表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料用卡方檢驗，四格表中期望值<5時，采用Fisher確切概率法等；對臨床病理特征及CYLD的相關性用Spearman相關性分析；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank檢驗分析CYLD表達對患者總體生存時間(OS)的影響，采用單因素和多因素COX回歸分析確定CYLD是否為胰腺癌患者的獨立預測因子。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織和正常組織中CYLD表達比較 免疫組化檢查結果顯示，正常胰腺組織中CYLD在胞質及胞核中均有不同程度表達，而癌組織中胞質染色明顯降低，胞核中幾乎不表達。胰腺癌組織切片中CYLD表達相對較弱，陽性表達率為45.45%(20/44)，而正常胰腺組織切片中CYLD表達較高，陽性表達率為75%(33/44),兩者比較差異有統計學意義(P=0.005)。

2.2 CYLD表達與胰腺癌患者臨床病理特征的關系 CYLD表達與胰腺癌患者的N分級(P=0.003)、AJCC分期(P=0.029)和組織分化程度(P=0.024)有關，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位及CA199水平表達無關(表1)。

2.3 CYLD表達與胰腺癌患者預后的相關性 Log-Rank檢驗顯示CYLD表達與胰腺癌患者的生存時間顯著相關(P=0.002)。另外，CYLD低表達者中位生存時間為8.27個月(95%CI，5.61～10.88個月)，2年累積生存率為5.4%，而CYLD高表達者中位生存時間為16.72個月(95%CI，14.12～19.31個月),2年累積生存率為17%。COX回歸分析結果提示M分級、AJCC分期和CYLD表達為胰腺癌患者的獨立預測因子(P均<0.05)。

表1 CYLD表達與胰腺癌患者臨床特征的關系

注：#采用Fisher確切概率法。

3 討論

CYLD是一種細胞內多功能去泛素化酶，能去除RIP1、TRAFs、NEMO和Bcl-3等信號分子K63多泛素化鏈，使其去泛素化而影響NF-κB、TGF-β及JNK等多條信號通路，從而調控細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及血管生成等多種生物學過程，在腫瘤發生發展過程中發揮抑癌基因的作用[2,3]。Hayashi等[4]采用qRT-PCR及免疫組化法檢測CYLD mRNA及蛋白在乳腺癌癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達，發現在乳腺癌組織中CYLD mRNA及蛋白表達均顯著降低甚至表達缺失。Herllerbrand等[5]采用qRT-PCR及免疫組化法檢測了結腸癌及HCC癌組織，發現CYLD在結腸癌及HCC癌組織中的表達顯著降低。同樣，CYLD在惡性黑色素瘤、宮頸癌、甲狀腺癌和慢性淋巴細胞性白血病等惡性腫瘤組織和(或)腫瘤細胞中低表達甚至不表達，而在正常組織和(或)細胞中高表達[6～9]。因此我們推測，CYLD失活在腫瘤發生發展過程中起重要調節作用。

本研究結果顯示，胰腺癌組織中CYLD表達顯著下降，通過免疫組化法檢測我們觀察到正常胰腺組織中CYLD蛋白在胞質和胞核內均有表達，但胰腺癌組織中CYLD表達下降，尤以胞核內下降顯著，在低-中分化胰腺癌中，胞核內CYLD幾乎不表達，提示核內CYLD表達與腫瘤預后存在一定聯系，此與Welte等[10]在肝癌中的研究結果相似。對CYLD表達與胰腺癌患者臨床病理特征間的相關性分析發現，CYLD表達與N分級、AJCC分期及組織分化程度有關。CYLD表達隨分化程度的降低而降低，隨AJCC分期的增加而降低。雖然分析結果提示CYLD表達與M分期無相關性，但9例遠處轉移的胰腺癌患者中，7例CYLD表達下降，這可能說明一定的趨勢，但仍需大樣本的統計分析。此外，通過Log-Rank檢驗發現CYLD與患者的生存時間相關，CYLD低表達者2年生存率明顯低于CYLD高表達者。單因素和多因素COX回歸分析顯示，CYLD為胰腺癌患者的獨立預后因子，此與其他研究者在乳腺癌、慢性淋巴瘤及肝癌中的結果一致[4,9,11]。徐小永等[12]研究結果顯示，CYLD基因轉染可抑制人胰腺癌PANC-1細胞的增殖并誘導其凋亡。提示CYLD或許可作為一項新的生物學標記物，有助于胰腺癌早期診斷、臨床分期及預后評估。

綜上所述，CYLD在胰腺癌組織中表達下調，其異常表達可能與胰腺癌發生發展有關，檢測其表達有助于患者預后判斷。

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周丁華(E-mail:zhoudh@sina.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.016

R735.9

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1002-266X(2017)09-0050-03

2016-11-25)