豬源纖維蛋白貼的黏附性及其對犬肝中葉及大鼠股動脈出血的止血效果

李偉達，鄧樂君，李健，萬華印，李茹冰

(1廣東藥科大學中藥學院，廣州510006；2廣州軍區廣州總醫院；3南方醫科大學；4廣州市拜特凇醫藥科技有限公司)

豬源纖維蛋白貼的黏附性及其對犬肝中葉及大鼠股動脈出血的止血效果

李偉達1,2，鄧樂君1,3，李健1，萬華印4，李茹冰1,2

(1廣東藥科大學中藥學院，廣州510006；2廣州軍區廣州總醫院；3南方醫科大學；4廣州市拜特凇醫藥科技有限公司)

目的 探討豬源纖維蛋白貼(DBT)的黏附性及對肝臟和股動脈出血創面的止血作用。方法 使用膠帶初黏性試驗機測試DBT和膠原蛋白的初黏性；選用健康Beagle犬24只，隨機分成模型對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組，建立犬肝臟出血創面模型，DBT組和醫用膠原蛋白組分別貼上DBT、醫用膠原蛋白，模型對照組直接用已稱重的紗布輕放于肝臟切口上，比較三組的出血時間和出血量，此外模型對照組和DBT組動物術前1周、術后2 d、3周、13周用負壓管從小隱靜脈取靜脈血2 mL，作凝血功能(PT、APTT、FIB)檢測。選用SD大鼠40只，隨機分為假手術組、紗布對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組，建立大鼠股動脈出血創面模型，DBT組和醫用膠原蛋白組分別用DBT、醫用膠原蛋白海綿包住動脈切口，紗布對照組則直接用已稱重紗布塊止血；假手術組只游離出股動脈，即刻縫合。比較四組的出血時間和出血量，計算止血成功率和再滲血率；同時觀察大鼠術后4周的創面恢復情況。結果 DBT的黏附性明顯優于膠原蛋白(P<0.01)；DBT組較模型對照組、醫用膠原蛋白組犬肝臟出血時間及出血量明顯減少(P均<0.01)，DBT組犬凝血功能未見明顯影響，術后13周能降解吸收完全，不影響創面的恢復。DBT組較紗布對照組、醫用膠原蛋白組大鼠出血時間及出血量明顯減少(P均<0.01)，大鼠的再滲血率降低；DBT組術后4周創面大部分將其降解、吸收。結論 豬源纖維蛋白貼黏附性較好，對犬肝臟和大鼠股動脈出血創面的止血效果較好，可降解吸收，且未對機體凝血功能造成影響。

肝臟出血；股動脈出血；纖維蛋白貼；止血效果；止血生物制品

出血是交通事故和外科手術治療中最常見的問題，尤其是肝臟等重要臟器的破裂出血可直接威脅生命[1]。目前，可吸收生物止血材料因其低抗原性、可降解性和良好的生物相容性等特點在醫用止血領域中日益受到關注。其中纖維蛋白類止血物是模擬人體凝血機理在創面形成網狀膠防止滲血，已從醫療器械轉為生物制品類藥物。本試驗使用的豬源纖維蛋白貼(DBT)是采用無菌的方法采集豬血漿，從中提取纖維蛋白原和凝血酶，從豬跟腱中提取膠原蛋白，最終與豬源性膠原蛋白一同凍干成海綿制劑。2016年4月，我們檢測了DBT的黏附性及對動物肝臟創面和股動脈切口的止血作用，并與臨床常用的醫用膠原蛋白海綿進行比較，為該類止血材料的研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Beagle犬，普通級，雌雄不限，體質量7.0～9.0 kg，8～10月齡，24只(高要市康達實驗動物科技有限公司)。SD大鼠，SPF級，雌雄不限，體質量200～220 g，6～8周齡，40只(廣州中醫藥實驗動物中心)。DBT[規格：(10×5×0.5) cm(廣州市拜特凇醫藥科技有限公司，批號20140606)，樣品-25 ℃保存]。豬源膠原蛋白海綿(DBM)，規格：(10×5×0.5)cm(廣州市拜特凇醫藥科技有限公司，批號20141226)。醫用膠原蛋白海綿，規格：(12×8×0.5)cm(無錫貝迪生物工程有限公司，批號20140407)。戊巴比妥鈉(Sigma)。10%水合氯醛(廣州軍區廣州總醫院)。注射用頭孢呋鋅鈉(山東羅欣藥業股份有限公司)。痛立定(法國威隆)。膠帶初黏性試驗機：東莞博萊德儀器設備有限公司。剃毛器：松下兒童理發器，ER353A。電子天平：METTLER TOLEDO，PL403。血凝分析儀：Beckman Coulter，ACL7000。

1.2 初黏性測試 取受試樣品DBT、DBM和醫用膠原蛋白海綿置于傾斜角為30 °的膠帶初黏性試驗機傾斜板中央，測試樣品的貼敷面朝上，斜面上部10 cm及下部15 cm用0.5 cm厚的塑料板覆蓋，中間留出5 cm的測試樣品面，并均勻噴灑1 mL生理鹽水，3 min后將6號鋼球自斜面頂端自由滾下，測試鋼球能否黏在樣品上，若能，則計為合格，統計合格率，并記錄鋼球在樣品上滾過的距離。

1.3 Beagle犬肝臟創面止血試驗 選用健康Beagle犬24只，隨機分成模型對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組，每組8只。用3%戊巴比妥鈉靜脈注射(1 mL/kg)麻醉，上腹部剃毛，并進行常規消毒，于上腹沿正中線切開表皮(約8 cm)、肌層和腹膜，撐開手術口，暴露肝臟，將其肝中葉游離于墊有潤濕的滅菌紗布塊上。接著用病理切片刀在肝臟表面切除一層8 cm×3.5 cm的組織，紗布按壓創面1 min，DBT組和醫用膠原蛋白組分別迅速貼上DBT、醫用膠原蛋白，再用經稱重的無菌紗布塊輕輕按壓創口，模型對照組直接用已稱重的紗布輕放在肝臟切口。記錄止血時間，計算出血量。止血后肝臟復位，分別縫合肌層和皮膚。連續3 d靜脈注射頭孢呋辛鈉0.75 g/d，肌注痛立定1 mL/d，連續2 d。此外模型對照組和DBT組動物術前1周、術后2 d、3周、13周用負壓管從小隱靜脈取靜脈血2 mL，作凝血功能(PT、APTT、FIB)檢測。于術后3、13周各組分別取4只Beagle犬開腹檢查腹腔內黏連和肝臟創面情況。

1.4 SD大鼠股動脈切口止血試驗 選用SD大鼠40只，隨機分為假手術組、紗布對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組，每組10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g，麻醉成功后，固定、腹股溝去毛、常規消毒，沿左側腹股溝切開表皮并鈍性游離出股動脈，近心端穿一細線，牽拉細線將動脈提起，用手術刀片于動脈上橫向切割制造約1/2的切口。松開細線，讓其自由出血5 s，DBT組和醫用膠原蛋白組分別用DBT、醫用膠原蛋白海綿包住動脈切口，再用已稱重的紗布塊按壓30 s，觀察出血情況，紗布對照組則以同樣方法直接用已稱重紗布塊止血。記錄出血時間，出血量統計方法同1.3。止血成功后3 min，最大限度屈伸左側髖關節、膝關節20次，探查止血材料是否脫離或創面滲血，并記錄。若10 min止血無效，則用細線結扎股動脈近心端。止血后，簡單縫合關閉腹股溝創口，假手術組大鼠只游離出股動脈，即刻縫合。4周后，再對大鼠右側股動脈進行同樣的止血試驗，之后解剖觀察左側腹股溝藥物的降解情況。

2 結果

2.1 初黏性測試結果比較 醫用膠原蛋白和DBM鋼球均滾出樣品外；而DBT樣品均能黏到鋼球，醫用膠原蛋白、DBM、 DBT鋼球停住位置的平均距離分別為>5 cm、>5 cm、(2.40±0.49)cm，醫用膠原蛋白、DBM與 DBT比較，P均<0.01。

2.2 Beagle犬肝臟創面止血效果比較 模型對照組、DBT組與醫用膠原蛋白組Beagle犬出血時間分別為(517.5±192.3)、(15.2±9.4)、(12.5±2.0)s, 出血量分別為(53.8±39.9)、(3.2±1.7)、(2.6±1.3)mL，模型對照組與DBT組及醫用膠原蛋白組出血時間和出血量比較，P均<0.01；DBT組與醫用膠原蛋白組出血時間和出血量比較，P均>0.05。術后2 d、3周、13周，各組動物的PT、APTT、FIB與自身術前1周比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，各組間PT、APTT、FIB亦未見統計學差異(P均>0.05)，見表1。術后3周大體解剖觀察，各組Beagle犬均無感染腫塊，創面基本愈合，肝葉有白色透明膜，DBT組可見2例動物有藥物殘留，各組動物均有不同程度的肝葉間黏連(或與脂肪黏連)情況；術后13周，DBT和醫用膠原蛋白基本降解吸收完全，無肉眼可見殘留物，各組動物的黏連面積和程度均有下降，黏連情況無明顯差別。

表1 模型對照組與DBT組不同時點的PT、APTT、FIB水平比較(±s)

2.3 SD大鼠股動脈切割止血效果比較 假手術組、出血不止，直至血管扁平，血液凝固。紗布對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組出血時間分別為(226.5±56.0)、(36.0±15.7)、(30.0±0.0)s,出血量分別為(0.56±0.21)、(0.12±0.07)、(0.11±0.10)mL，與紗布對照組比較，DBT組和醫用膠原蛋白組出血時間和出血量差異有統計學意義(P均<0.01)。紗布對照組、醫用膠原蛋白組和DBT組3 min內的止血成功率分別為45%、100%、100%，再滲血率分別為50%、5%、0%。術后4周左側股動脈創面觀察，各組動脈均無創口滲血，無明顯炎癥腫塊出現，部分動物創面可見乳白色透明膜(紗布對照組2例、醫用膠原蛋白組5例、DBT組2例)。DBT組有2例動物創面附近見芝麻大小淡黃色異物，疑似藥物殘留。

3 討論

纖維蛋白類止血材料的機理是模擬正常人體內凝血的最后反應階段，即纖維蛋白原在Ca2+與凝血酶的催化下形成纖維蛋白單體，凝血酶還能激活凝血因子ⅩⅢ成ⅩⅢa，使纖維蛋白單體相互結合成不溶性纖維蛋白多聚體[2～4]。作為外源性的止血膠，其并不依賴于機體的凝血成分，可用于正在服用抗凝藥物或有凝血功能障礙者。

本研究中應用的DBT是一種新型纖維蛋白止血材料，國內暫無相同產品。以豬源性作為制劑成分，能大大降低該類產品的成本；而豬血漿來源亦是用無菌的采血裝置采集(專利申請號：201520170962.1)，相對屠宰式豬血采集大大減少了污染的概率。該DBT制劑的纖維蛋白原面與創面少量血液接觸后，纖維蛋白原與凝血酶即可快速反應形成纖維蛋白網，數秒內DBT黏附創面而達到止血作用。膠原蛋白層則為按壓面，有效地阻攔沖破纖維蛋白多聚體的滲血，同時已有報道表明膠原蛋白能吸附血小板，誘導血小板激活發生聚集，形成血小板聚集物[5,6]。這樣纖維蛋白層與膠原蛋白層雙重阻擋創面的滲血，實現生化與機械止血相結合[7]，可提高止血效果。

初黏性指黏合劑在黏合作用初期的黏接性，采用斜面滾球法的原理，通過能黏住的最大鋼球號來表征制品的初黏性能。測試中以噴灑生理鹽水模擬血液與止血材料接觸，并以DBT能黏住的6號鋼球測試。本研究結果顯示，DBT遇液體后的體外黏附性明顯優于醫用膠原蛋白海綿。動物實驗中，DBT與醫用膠原蛋白海綿均能明顯降低Beagle犬肝臟和大鼠股動脈切口創面的出血量、縮短止血時間，且在肝臟和股動脈創面出血實驗中DBT組的平均出血時間和出血量均較醫用膠原蛋白海綿組少。已上市的醫用膠原蛋白海綿與創面的黏合力稍差；而多成分凍干的DBT貼片能更好地吸收血液，并與創面緊密結合，體外測試亦證明了二者的黏性效果差異。因此，DBT更能降低材料滑落或移位的風險，尤其在股動脈止血時，由于膠原蛋白的黏合力不強，且腹股溝處使用的止血材料較少，在包合動脈、紗塊按壓過程中，膠原蛋白易與紗布塊黏連，有時需更換新的膠原蛋白貼再次按壓方能止血，使得DBT在控制止血時間和出血量上略優于膠原蛋白海綿。此外，針對出血迅猛的創面，黏合力強的DBT更有利于疊加使用。

從試驗的止血時間看，DBT對犬的肝臟創面相比大鼠股動脈切口止血速度快，是因為實驗設計的區別導致。對于大創口滲血，接觸面積大，必須紗布按壓1 min對滲血量進行控制，再貼敷止血材料才能有效封閉創面。但鑒于大鼠股動脈較細，按壓過久易造成血管口暫時堵塞，不易對比觀察，在切割動脈時亦是選擇了細線提起而非止血鉗夾閉。提示該制劑臨床應用時，對大面積的滲血創面應先用紗布塊按壓止血，讓細微血管收縮后，再施以藥物加壓貼敷；對大血管的急性出血應在縫合后再包合該藥物以防滲血。本實驗結果顯示，DBT未引起犬的全身性凝血抗凝平衡失常。在犬和大鼠術后解剖檢查中，DBT不會對動物創面發生感染腫塊情況；提示DBT給藥量較大時，3～4周不能保證DBT成分能被機體降解完全；而在犬的肝創面術后13周可判斷DBT已降解吸收完全，無肉眼可見明顯異物。各組術后均有不同程度的黏連，但差異無統計學意義。黏連應為動物的機體自我修復過程，黏連程度亦隨術后時間延長而減弱。理論上，DBT的外層為膠原蛋白層，曾有報道膠原蛋白具有防黏連的效果，但若要確定DBT是否有致組織黏連或防黏連效果，則仍需進一步設計相關實驗研究。

上述實驗研究結果表明DBT海綿貼具有良好的止血效果，在體內可吸收降解，使用方便。

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廣州市科技計劃項目(201509010012)；重大新藥創制項目(2013ZX09J13110)。

李茹冰(E-mail:lrb90927@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.009

R605.972

A

1002-266X(2017)09-0031-03

2016-11-17)