銀杏內酯A對LPS誘發肝細胞損傷的保護作用及機制

姜璐，王偉芹，路士華，高金柱，曹志群

(1山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250014；2中國中醫科學院西苑醫院)

·基礎研究·

銀杏內酯A對LPS誘發肝細胞損傷的保護作用及機制

姜璐1，王偉芹1，路士華1，高金柱2，曹志群1

(1山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250014；2中國中醫科學院西苑醫院)

目的 探討銀杏內酯A(GA)對脂多糖(LPS)誘發肝細胞損傷的保護作用及可能機制。方法 將大鼠肝細胞隨機分為6組：正常組、LPS組、LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L +LY294002組。MTT法檢測細胞活性，Western blotting法檢測肝細胞Toll樣受體4(TLR4)表達，檢測肝細胞NF-κB活性[NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65 (p-p65)、磷酸化-IκBα (p-IκBα)、NF-κB p65基因結合活性]，檢測培養液中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。結果 與正常組比較，LPS組肝細胞TLR4表達增加(P<0.05)，NF-κB p65、p-p65、p-IκBα水平升高(P均<0.05)，NF-κB p65基因結合活性增強(P<0.05)，培養液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P均<0.05)，細胞活性降低(P<0.05)。與LPS組比較，GA劑量依賴性地抑制TLR4表達及NF-κB信號激活(P均<0.05)，降低上述炎癥因子的釋放(P均<0.05)，同時提高細胞活性(P<0.05)。TLR4抑制劑CLI-095干預后，LPS引起的肝細胞上述變化被阻斷(P<0.05)。PI3K/Akt抑制劑LY294002可抵消GA對肝細胞的保護作用(P均<0.05)。結論 GA可抑制LPS引起的肝細胞炎癥反應、提高細胞活性，其機制可能與抑制LPS引起的TLR-NF-κB信號過度激活有關；PI3K/Akt通路參與了LPS誘發肝細胞損傷過程。

肝細胞；銀杏內酯A；脂多糖；炎癥；Toll 樣受體4；核因子-κB

多種生物及非生物因素均可引起肝細胞炎癥反應，致肝臟損傷，抑制肝細胞過強的炎癥反應是一項重要的保護肝臟措施。在肝臟的炎癥反應過程中Toll 樣受體4(TLR4)-NF-κB信號通路有重要作用[1]。文獻顯示脂多糖(LPS)常用于制備肝細胞炎癥反應模型，其誘發炎癥的機制與TLR4-NF-κB信號通路有關[2]。銀杏內酯A(GA)是中藥銀杏干燥葉的提取物之一，研究[3]顯示，GA具有抗炎活性，但其對LPS誘發的肝細胞炎癥反應是否具有抑制作用鮮見報道。2015年6月，我們采用LPS誘發肝細胞炎癥反應，并觀察GA對肝細胞炎癥反應及TLR4-NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 GA(德國Fluka公司)；MTT、LPS、CLI-095、LY294002(美國Sigma公司)；DMEM培養液、胎牛血清(美國Gibco公司)；TLR4兔抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程公司)；NF-κB p65、p-p65、p-IκBα、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(武漢華美公司；Cell Signaling公司)；TranAMTMNF-κB p65 Chemi 轉錄因子分析試劑盒(美國Active Motif公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)；ChemiDoc XRS 化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2 大鼠原代肝細胞分離及培養 參照文獻[4]方法分離原代肝細胞，將SD大鼠麻醉后，膠原酶(0.5 g/L)兩步法對肝細胞進行原位灌流消化分離，以DMEM培養液(加入10%胎牛血清及20 U/L胰島素)洗滌細胞后進行重懸，細胞最終密度調整為1×106/L，將細胞接種于細胞培養瓶，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度環境中培養。

1.3 GA干預后肝細胞活性檢測 肝細胞常規培養24 h后，分別加入0、5、10、20、30 μmol/L GA繼續培養24 h，然后加入0.5 μg/mL的MTT避光培養4 h。移去孵育液，將培養皿底部的結晶加入DMSO進行溶解，酶標儀檢測570 nm波長下吸光度，評價細胞活性。

1.4 GA干預LPS孵育肝細胞后的活性檢測 將肝細胞分為6組：正常組、LPS組、LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L+LY294002組。肝細胞常規培養24 h后，各組分別加入相應藥物(其中LPS劑量為20 ng/mL；CLI-095劑量為5 μmol/L；LY294002劑量為10 μmol/L)繼續培養24 h。然后加入0.5 μg/mL的MTT避光培養4 h。移去孵育液，將培養皿底部的結晶加入DMSO進行溶解，酶標儀檢測570 nm波長下吸光度，評價細胞活性。

1.5 肝細胞TLR4表達檢測 采用Western blotting法。提取各組肝細胞總蛋白，取40 μg蛋白以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，轉移至硝酸纖維素膜，37 ℃環境中用封閉液封閉1 h后分別加入1∶1 000的TLR4、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入相應1∶1 000的二抗，37 ℃環境中孵育2 h，加入顯影液顯影后，通過化學發光成像系統檢測，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度比值作為蛋白相對表達量，實驗重復3次。

1.6 肝細胞中NF-κB活性測定 用細胞裂解液將細胞裂解，離心后收集上清液，參照文獻[5]報道采用ELISA法檢測其中的NF-κB p65、p-p65及p-IκBα。從肝細胞中提取核蛋白，參照文獻[5]采用TranAMTMNF-κB p65 Chemi 轉錄因子分析試劑盒檢測NF-κB p65基因結合活性。每個樣本設3個復孔，取平均值。

1.7 肝細胞中炎癥因子水平檢測 收集細胞培養液，采用ELISA法檢測培養液中IL-1β、IL-6及TNF-α，每個樣本設3個復孔取平均值，嚴格按說明書操作。

2 結果

2.1 GA對肝細胞的安全性評價 0、5、10、20、30 μmol/L GA培養肝細胞24 h，細胞活性分別為(100±5.64)%、(102±6.05)%、(105±6.99)%、(103±7.21)%、(106±8.02)%，各劑量間細胞活性比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

2.2 GA對LPS孵育肝細胞活性的影響 正常組、LPS組、LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L+LY294002組細胞活性分別為(100±6.37)%、(55.36±5.66)%、(95.35±6.94)%、(86.49±9.30)%、(69.61±5.27)%、(59.99±7.02)%，與正常組比較，LPS組細胞活性下降(P<0.05)。與LPS組比較，LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組與LPS+GA 10 μmol/L組細胞活性顯著升高(P均<0.05)，且LPS+GA 20 μmol/L組細胞活性高于LPS+GA 10 μmol/L組(P<0.05)。

2.3 GA對LPS孵育的肝細胞TLR4表達的影響 正常組、LPS組、LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L+LY294002組TLR4相對表達量分別為(0.18±0.03)%、(1.06±0.15)%、(0.38±0.05)%、(0.24±0.03)%、(0.59±0.07)%、(0.79±0.11)%，與正常組比較，LPS組TLR4表達顯著升高(P<0.05)。與LPS組比較，LPS+GA 20 μmol/L組與LPS+GA 10 μmol/L組TLR4表達顯著降低(P<0.05)，且LPS+GA 20 μmol/L組TLR4表達低于LPS+GA 10 μmol/L組(P<0.05)。

2.4 GA對LPS孵育的肝細胞NF-κB活性的影響 見表1。GA可劑量依賴性抑制LPS引起的NF-κB信號激活(P<0.05)，而PI3K/Akt抑制劑LY294002可抵消GA對NF-κB信號的抑制作用(P<0.05)。正常組、LPS組、LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L+LY294002組GA對LPS孵育的肝細胞NF-κB p65基因結合活性的OD值分別為0.23±0.03、0.79±0.11、0.30±0.04、0.36±0.06、0.58±0.08、0.68±0.08，與正常組比較，LPS組NF-κB p65基因結合活性升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+CLI-095組、LPS+GA 20 μmol/L組、LPS+GA 10 μmol/L組NF-κB p65基因結合活性下降(P均<0.05)；與LPS+GA 20 μmol/L組比較，LPS+GA 10 μmol/L組、LPS+GA 20 μmol/L+LY294002組NF-κB p65基因結合活性升高(P均<0.05)。

2.5 GA對LPS孵育的肝細胞炎癥因子水平的影響 見表1。

表1 GA對LPS孵育的肝細胞NF-κB信號及炎癥因子水平的影響(±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與LPS組比較，△P<0.05；與LPS+GA 20 μmol/L組比較，#P<0.05。

3 討論

多種肝臟疾病均涉及炎癥反應，抑制炎癥反應是多種肝臟疾病的重要治療策略之一。諸多中藥及其有效提取成分通過抗炎作用而起到肝臟保護作用。GA是中藥銀杏干燥葉的提取物之一，其在多種疾病的動物及細胞模型中顯示了良好的抗炎作用[3]，但其對肝細胞炎癥反應的作用報道較少。為了排除GA本身對肝細胞可能存在的毒性，本研究以不同濃度的GA孵育肝細胞，結果顯示0～30 μmol/L GA對肝細胞活性影響無統計學意義，表明在此濃度范圍內GA對肝細胞不產生毒性，可安全用于實驗。

LPS現已廣泛用于動物及細胞中誘發炎癥反應，制備炎癥模型。本研究采用LPS對肝細胞進行刺激，結果顯示經LPS刺激，肝細胞釋放大量炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α，這與既往文獻報道LPS增加細胞炎癥因子分泌的結果一致[6]。而經過GA治療，肝細胞釋放的上述炎癥因子顯著減少，表明GA對LPS引起的肝細胞炎癥反應有抑制作用。另外，本研究結果顯示LPS刺激后肝細胞活性顯著降低，而GA劑量依賴性提高肝細胞活性，表明GA對LPS引起的肝細胞損傷具有保護作用,可能與抑制LPS引起的炎癥反應有關。研究[7]顯示，LPS可通過TLR2、TLR4等發揮作用，其中TLR4是LPS的主要受體之一，TLR4被激活后可引起一系列炎癥反應。NF-κB是TLR4下游的一個重要轉錄因子[8]，通常位于細胞質內，因與抑制因子IκB結合而處于無活性狀態。當LPS與TLR4結合，IκB被磷酸化而失去對NF-κB的抑制作用，NF-κB發生磷酸化而被激活，進入細胞核促進其靶基因的轉錄，其中包括炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α等基因轉錄。本研究結果顯示，LPS能顯著增加肝細胞TLR4表達，TLR4下游的NF-κB信號被激活，表現為NF-κB p65、p-p65及p-IκBα水平顯著升高、NF-κB p65基因結合活性顯著增加。為確認TLR4在LPS導致的NF-κB激活及炎癥因子釋放中的作用，本研究在予以LPS刺激同時，將一組細胞予TLR4阻滯劑CLI-095，結果顯示CLI-095阻斷了LPS引起的肝細胞NF-κB激活及炎癥因子釋放，表明LPS引起的肝細胞NF-κB激活及炎癥因子釋放是由TLR4介導的。此與既往文獻報道結果一致[9]。另外，本研究結果顯示，GA劑量依賴性抑制LPS刺激引起的TLR4表達上調及NF-κB激活，提示GA抑制炎癥因子釋放的機制可能與抑制TLR4-NF-κB信號通路有關。

TLR4表達受多種信號調控，近年研究顯示PI3K/Akt是調節TLR4表達的重要信號通路[10,11]。在多種細胞中，PI3K/Akt激活可顯著減少LPS誘發的IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放。本研究結果發現LY294002可顯著抑制GA保護肝細胞、抑制NF-κB激活及炎癥因子釋放的作用，表明PI3K/Akt參與介導了GA的藥理作用發揮。

綜上所述，GA可抑制LPS引起的肝細胞炎癥反應、提高細胞活性，其機制可能與抑制LPS引起的TLR-NF-κB信號過度激活有關；PI3K/Akt通路參與了LPS誘發肝細胞損傷過程。

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山東省中醫藥管理局基金資助項目(2009-33)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.008

R575

A

1002-266X(2017)09-0028-03

2016-12-25)