Psammaplin A對離體結腸癌SW480細胞增殖、凋亡的影響及機制

劉海宏，孟慶凱，石剛

(1東北大學醫院，沈陽110004；2中國醫科大學腫瘤醫院)

Psammaplin A對離體結腸癌SW480細胞增殖、凋亡的影響及機制

劉海宏1，孟慶凱2，石剛2

(1東北大學醫院，沈陽110004；2中國醫科大學腫瘤醫院)

目的 探討組蛋白去乙酰化3(HDAC3)抑制劑Psammaplin A對離體結腸癌細胞增殖、凋亡的影響及機制。方法 取處于對數生長期結腸癌SW480細胞，隨機分為Psammaplin組與對照組，Psammaplin組給予不同濃度(0.5、5、50、500、5 000 μg/mL)Psammaplin A干擾48 h，對照組不給予任何干預。采用Western blotting法檢測HDAC3及DNMT3a蛋白表達：MTT法檢測不同細胞培養時間(24、48、72、96 h)、不同濃度梯度Psammaplin A對SW480細胞增殖的影響。流式細胞術檢測Psammaplin A對SW480細胞周期及凋亡的影響。結果 Psammaplin組0.5、5、50、500、5 000 μg/mL的Psammaplin A干擾SW480細胞48 h后，HDAC3蛋白相對表達量分別為23.28±8.91、21.72±9.18、18.63±7.26、14.17±5.64、10.58±7.22，對照組HDAC3蛋白相對表達量為24.84±7.65，與對照組比較，Psammaplin組在500及5 000 μg/mL時差異有統計學意義(P均<0.05)。Psammaplin組0.5、5、50、500、5 000 μg/mL的Psammaplin A干擾SW480細胞48 h后，DNMT3a蛋白相對表達量分別為18.36±8.43、17.51±6.29、16.12±6.54、11.27±5.31、10.54±4.26，對照組為20.15±6.31，與對照組比較，Psammaplin組在500及5 000 μg/mL時差異有統計學意義(P均<0.05)。50 μg/mL的Psammaplin A干預SW480細胞培養24、48、72及96 h后，Psammaplin組細胞存活率為時間依賴性下降，與對照組比較，在48、72及96 h時差異均有統計學意義(P均<0.05)；Psammaplin組0.5、5、50、500、5 000 μg/mL的Psammaplin A作用48 h后，與對照組比較，SW480細胞存活率呈劑量依賴性下降，在50、500、5 000 μg/mL時差異有統計學意義(P均<0.05)。Psammaplin組與對照組G1期細胞所占比例分別為(69.27±0.93)%、(81.25±0.89)%，G2期細胞所占比例分別為(4.72±1.83)%、(9.62±1.34)%，S期細胞所占比例分別為(27.61±1.65)%、(10.43±0.97)%，兩組各期細胞所占比例比較，P均<0.05。Psammaplin組與對照組細胞凋亡率分別為56.98%、31.67%，兩組比較，P<0.01。結論 Psammaplin A可通過抑制HDAC3及DNMT3a表達降低結腸癌細胞存活率及增殖活性，誘導凋亡。

結腸癌；Psammaplin A；組蛋白去乙酰化3蛋白;DNA甲基化3a蛋白

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國及歐美國家發病率呈逐年遞增趨勢，在惡性腫瘤中位居第三位，病死率位居第四位[1]。目前大腸癌治療方式有根治性手術、輔助化療、放療、免疫治療、靶向治療及中醫藥綜合治療等[2～4]。對于不能手術根治的直腸癌藥物治療方法仍在探索中，多藥耐藥是大腸癌藥物治療受限的重要因素[5]。組蛋白去乙酰化(HDAC)及DNA甲基化(DNMT)與大腸癌關系密切，有對基因轉錄抑制方面的協同作用，如對DNMT3a進行靶向抑制，可能解除抑癌基因的轉錄抑制狀態，為新的靶向藥物研發提供新的候選靶點[6]。Psammaplins化合物是一類酚類化合物，Psammaplin A是其重要一員，最早從海綿體生物中分離提取出來[7]，對多種腫瘤細胞有細胞毒性作用。2016年1～5月，我們用Psammaplin A處理離體結腸癌細胞株，觀察細胞增殖、凋亡及細胞周期變化，探討其作為結腸癌治療的靶向藥物可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株SW480購自中科院上海細胞庫，低溫冰箱保存(實驗前先對細胞進行復蘇處理，采用含5%胎牛血清、10%FBS液、100 U/mL青霉素及鏈霉素的DMEM培養基于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。以0.25%胰蛋白酶對融合度達到90%的細胞進行消化傳代，選取對數生長期細胞進行實驗，實驗過程均重復3次，取平均值統計分析)。Psammaplin A(CAS No：110659-91-1)購自北京博奧派克生物有限公司，HDAC3多克隆抗體、DNMT3a多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司，DAB顯色試劑盒及BCA定量試劑盒購自大連寶生生物技術有限公司;MTT及Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

1.2 細胞分組及Psammaplin A干預后SW480中HDAC3、DNMT3a蛋白表達檢測 取處于對數生長期的人結腸癌細胞株SW480，隨機分為Psammaplin組與對照組，Psammaplin組給予不同濃度梯度Psammaplin A(0.5、5、50、500、5 000 μg/mL)干擾48 h，對照組不給予任何干預。采用Western blotting法檢測HDAC3及DNMT3a蛋白表達：按照蛋白提取試劑盒說明書進行細胞的蛋白提取，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入一抗，孵育過夜后加入相應二抗，再次孵育，應用化學發光法顯色，β-actin為內參照。應用QuantityOne進行灰度值檢測，蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值。

1.3 細胞分組及Psammaplin A干預后SW480細胞存活率測算 取處于對數生長期的人結腸癌細胞株SW480，以5×103/孔的密度接種于96孔細胞培養板內，設立3個復孔，細胞貼壁后Psammaplin組加入0.5、5、50、500、5 000 μg/mL的Psammaplin A作用48 h，對照組給予DMSO作用48 h作為Psammaplin組的平行對照，每個濃度均設3個復孔。細胞培養48 h后在每個孔內加入10% MTT液于37 ℃溫箱內孵育4 h，棄上清后加150 μL DMSO，振蕩20 min，測定光密度值，計算細胞存活率。另取貼壁細胞，Psammaplin組加入50 μg/mL的Psammaplin A，對照組給予DMSO作為平行對照,細胞培養24、48、72、96 h后進行MTT檢測，步驟同前，測定細胞在不同培養時點存活率。

1.4 Psammaplin干預SW480后細胞周期檢測 取Psammaplin組50 μg/mL Psammaplin A干預48 h的SW480細胞及對照組細胞，轉移到EP管內，預冷PBS 1 mL洗滌后加入1 mL預冷70%乙醇，吹打混勻，4 ℃下固定24 h，1 200 g離心4 min。棄上清后預冷PBS 1 mL洗滌。每個樣品均采用PBS液進行重懸，加0.5%PI 30 μL、15 μL RNase A(10 mg/mL)，在4 ℃下避光溫浴35 min。上流式細胞儀，激發波長488 nm，檢測細胞周期。

1.5 Psammaplin干預SW480后細胞凋亡率檢測 取Psammaplin組50 μg/mL Psammaplin A干預48 h的SW480細胞及對照組細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟操作，流式細胞儀Alexa FITC最大激發波長設定為488 nm，最大發射波長設定為509 nm，PI-DNA復合物最大激發波長設定為535 nm，最大發射波長設定為615 nm，每個樣本采集細胞數為10 000個，應用Cell Quest軟件進行分析凋亡細胞數。

2 結果

2.1 兩組HDAC3及DNMT3a蛋白表達比較 不同濃度梯度(0.5、5、50、500、5000 μg/mL)Psammaplin A干擾SW480細胞48 h后，Psammaplin組HDAC3蛋白相對表達量分別為23.28±8.91、21.72±9.18、18.63±7.26、14.17±5.64、10.58±7.22，對照組為24.84±7.65，與對照組比較，Psammaplin組在500及5 000 μg/mL時差異有統計學意義(t=3.982，P<0.05；t=7.204，P<0.01)。不同濃度梯度(0.5、5、50、500、5 000 μg/mL)Psammaplin A干擾SW480細胞48 h后，Psammaplin組DNMT3a蛋白相對表達量分別為18.36±8.43、17.51±6.29、16.12±6.54、11.27±5.31、10.54±4.26，對照組為20.15±6.31，與對照組比較，Psammaplin組在500及5 000 μg/mL時差異有統計學意義(t=3.982，P<0.05；t=7.204，P<0.01)。HDAC3及DNMT3a蛋白表達均呈現劑量依賴性下降。

2.2 兩組SW480細胞存活率比較 Psammaplin A(50 μg/mL)干預SW480細胞培養24、48、72及96 h后，Psammaplin組細胞存活率呈時間依賴性下降，與對照組比較，在48、72及96 h時差異均有統計學意義(t=4.534，P<0.05；t=6.249，P<0.01；t=12.593，P<0.01)，見圖1A；Psammaplin組加入不同濃度(0.5、5、50、500、5 000 μg/mL)的Psammaplin A作用48 h后，與對照組比較，SW480細胞存活率呈劑量依賴性下降，在濃度(50、500、5 000 μg/mL)時差異有統計學意義(t=3.182，P<0.05；t=6.947，P<0.01；t=14.062，P<0.01)，見圖1B。

注：A為Psammaplin A(50 μg/mL)干預SW480細胞培養24、48、72及96 h；B為0.5、5、50、500、5 000 μg/mL的Psammaplin A作用48 h。

圖1 MTT檢測不同時間、不同濃度Psammaplin A處理后細胞存活率

2.3 兩組細胞周期比較 Psammaplin組與對照組G1期細胞所占比例分別為(69.27±0.93)%、(81.25±0.89)%，G2期細胞所占比例分別為(4.72±1.83)%、(9.62±1.34)%，S期細胞所占比例分別為(27.61±1.65)%、(10.43±0.97)%，兩組各期細胞所占比例比較，差異均有統計學意義(t=3.148，P<0.05；t=2.926，P<0.05；t=4.127，P<0.05)。

2.4 兩組細胞凋亡率比較 Psammaplin 組與對照組細胞凋亡率分別為56.98%、31.67%，兩組比較，差異有統計學意義(t=9.573，P<0.01)。

3 討論

隨著飲食結構改變，高蛋白、高脂肪、低纖維素飲食結構使我國大腸癌的發病率年均以4.2%速度上升，且發病年齡有年輕化趨勢。結直腸癌的發病經歷由正常腸上皮向侵襲性轉變的癌變過程，同時上皮細胞生長抑制能力喪失，這個過程具有多因素、多步驟及內外因交互作用的多方面影響[8]。抑癌基因被異常甲基化和異常組蛋白去乙酰化沉默是惡性腫瘤發生及進展的重要因素之一，HDAC抑制劑(HDACi)會使染色質組蛋白乙酰化水平提高，因此導致特定基因激活表達，相應地導致細胞末端分化或癌細胞凋亡[9]。臨床研究表明，人類可安全地通過抑制HDAC的活性來獲得組蛋白高乙酰化水平。在多種腫瘤中DNMTi和HDACi同樣被證明具有治療作用，可使腫瘤中的抑癌基因重新表達，誘導細胞分化、抑制生長，誘導凋亡等[10]。以上研究結果為我們進一步研究DNMTi和HDACi抗大腸癌提供了依據。因此DNA甲基化和組蛋白去乙酰化導致的基因沉默可應用DNMT和HDAC抑制劑逆轉。

Psammaplin A是HDACi抑制劑之一，其在乳腺癌、卵巢癌及頭頸部腫瘤中抑制惡性腫瘤細胞生長的作用已被研究證實，但其在結直腸癌細胞中的研究目前鮮見報道。本研究結果顯示，采用不同濃度梯度Psammaplin A干擾SW480細胞后，HDAC3及DNMT3a蛋白均呈劑量依賴性下降，表明Psammaplin A對HDAC3及DNMT3a具有雙重抑制作用，這種抑制作用在結腸癌細胞中表現出明顯效果。MTT檢測結果顯示，Psammaplin A干預SW480細胞存活率呈時間依賴性及劑量依賴性下降，SW480細胞表現出增殖減少，生存減低，證明了Psammaplin A的細胞毒性及殺滅結腸癌細胞的有效性。進一步流式細胞儀檢測結果顯示，Psammaplin A干預SW480細胞后停留于G1期及G2期比例減少，S期比例升高，SW480細胞凋亡率升高。說明Psammaplin A誘導細胞周期減緩，腫瘤細胞凋亡增加。Kim等[11]研究顯示，Psammaplin A可誘發離體乳腺癌細胞的自嗜性死亡。Psammaplin A通過含水的氫鍵與HDAC1的Asp99位點作用，吸附于苯環的側位，與通道激活入口處的Glu203位點作用，從而抑制HDAC1活性[12]。Psammaplin A對HDAC1的抑制作用具有高效及高選擇性[13]，但Psammaplin A的毒性作用目前研究較少，有研究[14]顯示，其可誘發紅細胞的自殺性死亡，但其對結腸癌細胞的殺滅作用及在體的毒性作用需進一步深入研究。

綜上所述，Psammaplin A可通過抑制HDAC3及DNMT3a表達降低結腸癌細胞存活率及增殖活性，從離體細胞實驗初步顯示其可能作為結腸癌治療靶向候選藥物之一，但需進一步的在體實驗及臨床試驗等深入研究才能證明其可應用性。

[1] Luo G, Zhang Y, Wang L, et al. Risk of colorectal cancer with hysterectomy and oophorectomy: A systematic review and meta-analysis[J]. Int J Surg, 2016,26(8):88-95.

[2] Sun X, Suo J, Yan J. Immunotherapy in human colorectal cancer: Challenges and prospective[J]. World J Gastroenterol, 2016,22(28):6362-6372.

[3] Demetter P, Jouret-Mourin A, Silversmit G, et al. Review of the quality of total mesorectal excision does not improve the prediction of outcome[J]. Colorectal Dis, 2016,18(9):883-888.

[4] Sievers CK, Kratz JD, Zurbriggen LD, et al. The multidisciplinary management of colorectal cancer: present and future paradigms[J]. Clin Colon Rectal Surg, 2016,29(3):232-238.

[5] Zhai Z, Yu X, Yang B, et al. Colorectal cancer heterogeneity and targeted therapy: clinical implications, challenges and solutions for treatment resistance[J]. Semin Cell Dev Biol, 2016,35(8)30267-30271.

[6] Flis S, Gnyszka A, Flis K. DNA methyltransferase inhibitors improve the effect of chemotherapeutic agents in SW48 and HT-29 colorectal cancer cells[J]. PLoS One, 2014,9(8):e106142.

[7] Baud MG, Leiser T, Petrucci V, et al. Thioester derivatives of the natural product psammaplin A as potent histone deacetylase inhibitors[J]. Beilstein J Org Chem, 2013,26(9):81-88.

[8] Abdelfatah E, Kerner Z, Nanda N, et al. Epigenetic therapy in gastrointestinal cancer: the right combination[J]. Therap Adv Gastroenterol, 2016,9(4):560-579.

[9]Khoram-Abadi KM, Forat-Yazdi M, Kheirandish S, et al. DNMT3B -149 C>T and -579 G> T polymorphisms and risk of gastric and colorectal cancer: a meta-analysis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016,17(6):3015-3020.

[10]Clawson GA. Histone deacetylase inhibitors as cancer therapeutics[J]. Ann Transl Med, 2016,4(15):287.

[11] Kim TH, Kim HS, Kang YJ, et al. Psammaplin A induces Sirtuin 1-dependent autophagic cell death in doxorubicin-resistant MCF-7/adr human breast cancer cells and xenografts[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1850(2):401-410.

[12] Wen J, Bao Y, Niu Q, et al. Synthesis, biological evaluation and molecular modeling studies of psammaplin A and its analogs as potent histone deacetylases inhibitors and cytotoxic agents[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2016,26(17):4372-4376.

[13] Baud MG, Haus P, Leiser T, et al. Highly ligand efficient and selective N-2-(Thioethyl)picolinamide histone deacetylase inhibitors inspired by the natural product psammaplin A[J]. Chem Med Chem, 2013,8(1):149-156.

[14] Al Mamun Bhuyan A, Signoretto E, Lang F. Triggering of Suicidal Erythrocyte Death by Psammaplin A[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,39(3):908-918.

Effect of Psammaplin A on proliferation and apoptosis of colon cancer SW480 cells in vitro

LIUHaihong1,MENGQingkai,SHIGang

(1HospitalofNortheastUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To observe the effect of histone deacetylase 3 (HDAC3) inhibitor Psammaplin A on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells in vitro. Methods Colon cancer SW480 cells in logarithmic phase were randomly divided into Psammaplin group and control group. Different concentrations of Psammaplin A (0.5, 5, 50, 500 and 5 000 μg/mL) were given and interfered for 48 h to cells in the Psammaplin A group, and no interference was given to cells in the control group. HDAC3 and DNMT3a protein expression was detected by Western blotting. MTT assay was used to detect the proliferation of SW480 affected by Psammaplin A in different concentrations and culture time (24, 48, 72, 96 h). Flow cytometer was used to detect the cell cycle and apoptosis affected by Psammaplin A. Results HDAC3 relative protein expression in the Psammaplin group which was interfered by 0.5, 5, 50, 500 and 5 000 μg/mL Psammaplin A for 48 h was 23.28±8.91, 21.72±9.18, 18.63±7.26, 14.17±5.64, 10.58±7.22, and 24.84±7.65 in the control group. Compared with control group, the differences were significant in the Psammaplin at 500 and 5 000 μg/mL (allP<0.05). DNMT3a relative protein expression in the Psammaplin group which was interfered by 0.5, 5, 50, 500 and 5 000 μg/mL Psammaplin A for 48 h was 8.36±8.43, 17.51±6.29, 16.12±6.54, 11.27±5.31 and 10.54±4.26, and 20.15±6.31 in the control group. Compared with control group, the differences were significant in the Psammaplin at 500 and 5 000 μg/mL (allP<0.05). After SW480 cells were interfered with 50 μg/mL Psammaplin A and cultured for 24, 48, 72 and 96 h, the survival rate in the Psammaplin group was decreased in a time-dependent manner. Compared with the control group, the difference was significant at 48, 72 and 96 h (allP<0.05). The survival rate in the Psammaplin group treated with 0.5, 5, 50, 500 and 5 000 μg/mL Psammaplin A for 48 h was decreased in a dose-dependent manner, and the different was significant at 50, 500 and 5 000 μg/mL as compared with survival rate in the control group (allP<0.05). The percentages of cells in G1phase of the Psammaplin group and control group were 69.27%±0.93% and 81.25%±0.89%, respectively, and those in the G2phase were 4.72%±1.83% and 9.62%±1.34%, in S phase were 27.61%±1.65% and 10.43%±0.97%, and the differences were significant (allP<0.05). The apoptosis rate in the Psammaplin group and control group was 56.98% and 31.67%, respectively, and the difference was significant (P<0.01). Conclusion Psammaplin A decreases the survival rate and proliferation of colon cancer cells by inhibiting the expression of HDAC3 and DNMT3a, and induces apoptosis.

colon carcinoma; Psammaplin A; histone deacetylase 3 protein; DNA methyltransferase 3a protein

遼寧省自然科學基金資助項目(2014020102)；遼寧省省直醫院臨床能力建設青年項目(LNCCC-D46-2015)。

劉海宏(1980-)，男,主治醫師,主要研究方向為結直腸腫瘤的綜合治療及其機制。E-mail:bluesky2016@aliyun.com

孟慶凱(1972-)，男，主任醫師，主要研究方向為結直腸惡性腫瘤的基礎與臨床。E-mail:mqk1971@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.002

R735.35

A

1002-266X(2017)09-0005-04

2016-09-10)