呈味肽的制備、純化與鑒定

鄧莉，郝學財，劉娜

（天津春發生物科技集團有限公司研發中心天津市風味食品配料企業重點實驗室，天津300300）

呈味肽的制備、純化與鑒定

鄧莉，郝學財，劉娜

（天津春發生物科技集團有限公司研發中心天津市風味食品配料企業重點實驗室，天津300300）

采用酶解法以雞肉為原料進行雞肉蛋白多肽的制備，通過葡聚糖凝膠柱層析法對混合多肽進行不同分子質量片斷的分離，確定最優的分離填料為G25、洗脫液為乙醇-水，在此條件下，分子質量＜1 000 u的組分通過分離富集含量可達100%、分子質量＞5 000 u的組分含量達78%、分子質量1 000～5 000 u的組分含量達70%。通過感官評價、電子舌分析發現，不同分子質量片段多肽提供的風味側重點不同，分子質量＜1 000 u的多肽熱反應產物在醇厚感、嗜好性方面最優。利用高效液相色譜、液質聯用儀對該肽段進一步純化與鑒定，找到其中5條呈味肽，并采用固相合成法制備，經感官評價驗證其呈味功能，發現在清水評價中，合成的5條多肽呈味效果以酸、甜、鮮味為主；在雞粉溶液加香評價中，呈現鮮味最強的多肽為γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈現醇厚感最強的多肽為L-GSH。

呈味肽；酶解；分離；純化；鑒定

呈味肽是指對食品風味具有一定貢獻的寡肽類物質，通常分子質量＜5 000 u。肽由于含有羧基和氨基兩性基團而具有緩沖能力，可賦予食品微妙而細膩的風味。肽不僅可以直接呈味，而且可以與其他風味物質相互協同，增強或改變原有的味道，也可以作為揮發性風味物質的前體參與美拉德反應，形成特殊的芳香化合物[1-2]。

研究表明，肽的呈味功能與其含有的氨基酸種類及序列相關，存在于天然食品中的氨基酸大約有20余種，無論是單一還是混合的氨基酸，都可以清楚地評估出其對食品呈味的作用。然而，肽類是由氨基酸排列組合構成，其數量十分龐大，利用現有的分離、分析技術逐一對其進行分離、純化、鑒定、評估極其困難。目前，呈味肽的研究在國內尚處于起步階段，國外不同學者的研究結論也存在爭議[3-5]。

本實驗采用酶解法以雞肉為原料進行雞肉蛋白多肽的制備，經柱層析實現不同分子質量多肽的分離，利用感官評價、電子舌技術確定最具呈味功能的多肽片斷，再利用高效液相色譜、液質聯用儀純化、鑒定出5條呈味肽，而后，采用固相合成法制備并驗證了其呈味功能，以期為新型呈味物質的發現、應用以及高品質香精、調味品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉：山東鳳翔集團；復合蛋白酶（FH-G-NA-ⅩⅡ）：天津諾奧科技發展有限公司；葡聚糖凝膠柱填料（G10、G15、G25）：北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸（純度均為99%）：日本味之素公司；乙腈、乙醇（純度均為色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、磷酸二氫鈉、苯酚（純度均為99%）：天津市風帆化學試劑科技有限公司；標準品細胞色素C、抑肽酶（6 500 U/g）、桿菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸（純度均為99%以上）：美國Sigma公司；H-CTC樹脂：天津南開和成公司；N，N'-二異丙基碳二亞胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）、1-羥基苯并三唑（Nhydroxybenzotrizole，HOBt）（純度均為99%）：成都西亞化工股份有限公司；乙二硫醇（1,2-ethanedithio，EDT）、茚三酮、六氫吡啶（piperidine，PIPE）、N,N′-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）（純度均為99%）：百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AC1000全自動熱反應釜：北京世紀森朗實驗儀器有限公司；1200高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（帶餾分收集器）：美國安捷倫科技有限公司；3100 Mass液質聯用儀（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：美國沃特世科技（上海）有限公司；JMS-50膠體磨：頂天輕工機械有限公司；SJM-FHM-05陶瓷膜過濾裝置：世杰膜工程有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司；BS-100A自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；Astree電子舌：法國Alpha MOS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞肉多肽的制備

取雞肉，先后利用破碎機、膠體磨處理成雞肉泥，肉泥與水等質量充分混合，加入蛋白酶酶解，加酶量為1 000 U/g蛋白質，在自然pH，酶解溫度為65℃條件下酶解0.5 h后，于90℃滅酶15 min，降溫后過陶瓷膜濾去大分子雜質。

1.3.2 多肽的分離

將1.3.1中得到的酶解液采用葡聚糖凝膠過濾柱法進行不同分子量多肽的分離。首先以葡聚糖凝膠G25為填料填裝層析柱，以水、乙醇-水、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer solution，PBS）、NaCl-PBS四種洗脫液分別洗脫，考察得到最優的洗脫液種類；再分別以G25、G15、G10為填料填裝層析柱，在其他條件不變的情況下，考察得到最適的填料種類。實驗利用自動餾分收集器進行級分收集，間隔時間為5 min，洗脫速度為1 mL/min。

1.3.3 分離效果檢測方法

采用凝膠過濾色譜法測定多肽分離效果，實驗儀器為HPLC，色譜柱選用TSK-GELG2000SWXL7.8mm×300mm，色譜條件為柱溫30℃，流動相乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1，流速為0.5mL/min，檢測波長220nm，進樣量為10mL。以標準品細胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸做分子質量分布標準曲線。

1.3.4 不同分子質量多肽的風味評價

（1）美拉德反應

按照表1基本配方，分別稱取1.3.2中得到的不同分子質量肽段多肽、未分離多肽、空白對比樣，與其他美拉德反應原料一同投入反應釜中，溫度升至99℃時，開始計時，保持（100±1）℃，反應90 min，冷卻降溫，取樣品進行感官評價及電子舌分析。

表1 反應物配方Table1 Formula of reaction substrate

（2）感官評價

取上述美拉德反應后的樣品，用55℃純凈水稀釋100倍后，進行感官評價。感官評價小組由8名訓練有素的感官評價員組成，每評價一個樣品后需用清水漱口。

感官評價指標包括雞肉特征、鮮味、醇厚感、持續性、嗜好性，每個指標按照強度的由弱到強，在0～9分范圍內評分。

（3）電子舌分析

本實驗所用電子舌設備的傳感器系統包括酸味（sourness，SRS），甜味（sweetness，SWS），苦味（bitterness，BRS），咸味（saltiness，STS），鮮味（umami，UMS），綜合1（GPS）綜合2（SPS）共7根傳感器，選擇Ag/AgCl作為參比電極。傳感器經活化、校正后測樣。

樣品處理方法為取上述美拉德反應后的樣品1 g，加入100 mL蒸餾水溶解、過濾后，添加于專用的25 mL燒杯中檢測。

1.3.5 呈味肽的純化

利用反相高效液相色譜對1.3.4中風味評價效果最優的肽段中的混合多肽進一步純化。高效液相色譜法的分離純化條件為色譜柱XDB C18；流動相采用A：0.05%TFA-水、B：0.05%TFA-乙腈洗脫；流速1.0mL/min；檢測波長220nm；柱溫30℃。

1.3.6 呈味肽的鑒定

利用液質聯用儀對1.3.5中純化后的多肽進行進一步分離、鑒定其氨基酸序列。質譜檢測條件為模式ESI+/ESI-，電離電壓3.2 kV，離子源溫度120℃，霧化溫度350℃，霧化氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h，錐孔電壓30 V。

1.3.7 呈味肽的合成[6-27]

根據1.3.6中鑒定出的多肽序列，結合文獻報道的氨基酸、多肽呈味效果，選擇其中5條最有可能具有呈味貢獻的多肽進行固相合成。合成、純化方法如下：

采用手動固相Fmoc法，以H-CTC樹脂（取代值為1.0 mmol/g）為起始原料，從C端向N端方向合成。用2倍當量Fmoc-AA-OH/DIPEA與樹脂進行接枝引入C端第一個氨基酸殘基，反應時間2 h。而后，用25%六氫吡啶/DMF（體積比）去除N端Fmoc保護基使N端成為自由氨基。用3倍當量Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt與樹脂反應以接枝第二個氨基酸殘基。如此反復依次連接各個氨基酸殘基以完成整條多肽的合成。以上每步反應后都需用DMF洗滌樹脂6次以上，并且都通過Kaiser Test檢測來對反應進行控制，若某個氨基酸縮合反應不完全，重復縮合一次，直至得到所需的目標肽段。切割及去側鏈保護，使用切割試劑（三氟乙酸∶1,2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶苯酚∶H2O∶三異丙基硅烷=68.5∶10∶10∶5∶3.5∶1，V/V）將目標多肽從樹脂上裂解下來并除去側鏈保護基（30℃條件下切割3h）。濾液加入到大量冷的水/乙醚中進行萃取，水相凍干即得到多肽粗品。

多肽的純化及表征，采用HP1200型反相高效液相色譜儀對合成肽粗品進行純化。色譜柱型號：uiso C18（10 μm，100?，50mm×250mm），色譜操作條件：流動相A為含0.05%三氟乙酸，2%乙腈的水溶液，流動相B為90%乙腈/水，流速25 mL/min，紫外檢測波長220 nm。反復凍干去除溶劑后即得多肽純品。純度由分析型高效液相色譜儀給出。

1.3.8 呈味肽的呈味功能驗證

（1）清水評價方法：將合成的多肽配制成0.1%濃度的水溶液，評價其風味強度、和諧性并進行整體風味特征描述，以了解多肽的基本味覺特性。并與目前報道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽作對比評價。

（2）雞粉溶液加香評價方法：將合成的多肽配制成含0.05%肽、0.5%雞粉、0.2%NaCl的水溶液，與空白、谷胱甘肽對比評價其在肉味、鮮度、醇厚感、酸味方面的呈味效果。

2 結果與分析

2.1 多肽的分離

2.1.1 柱分離洗脫液種類考察

將1.3.1中得到的酶解液，采用葡聚糖凝膠過濾柱法進行不同分子質量多肽的分離。以葡聚糖凝膠G25為填料填裝層析柱，分別采用水、乙醇-水、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、NaCl-PBS四種洗脫液洗脫，單因素考察不同洗脫液的分離效果。利用自動餾分收集器進行級分收集，間隔時間為5 min，將收集到的不同級分經凝膠過濾色譜測定，將分子質量相近的級分合并，得到分子質量由高到低三個片段，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再進行分子質量測定，評估分離效果，結果見表2。

本實驗采用的葡聚糖凝膠填料Sephadex屬于凝膠過濾層析填料，主要依據多肽的分子大小和形狀進行分離，通常大分子物質先被洗脫出來，而后小分子被洗脫。由表2結果可知，4種洗脫液洗脫得到的Ⅲ組分分子質量均＜1000u，分離效果理想；組分Ⅰ中5 000 u以上部分含量增加較多，增加最多的（乙醇-水洗脫）可以由原液的39.2%提升至77.9%；組分Ⅱ中1 000～2 500 u和2 500～5 000 u含量較低，但1 000～5 000 u總體可達70%?？梢姡瑯悠妨鹘浧暇厶悄z柱可以實現不同分子質量多肽的有效分離。從不同洗脫液的分離結果看，乙醇-水分離效果最優。

表2 不同洗脫液分離樣品分子質量分布測定結果Table 2 Determination results of the molecular mass distribution separated by different eluents

2.1.2 柱分離填料考察

分別以G25、G15、G10為填料填裝層析柱，在其他條件不變的情況下，單因素考察得到最適的填料種類。利用自動餾分收集器進行級分收集，間隔時間為5 min，將收集到的不同級分經凝膠過濾色譜測定，將分子質量相近的級分合并，得到分子質量由高到低三個片段，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再進行分子質量測定，評估分離效果，結果見表3。

表3 不同填料層析柱分離樣品分子質量分布測定結果Table 3 Determination results of the molecular mass distribution separated by different packing chromatographic column

Sephadex填料是由葡聚糖通過環氧氯丙烷交聯形成的三維網狀凝膠顆粒，商品化的Sephadex填料，按交聯度不同，用Sephadex G加一個數字來區別型號，數字越小，表示介質交聯度越大，分級范圍越小，反之亦然。由表3結果也可證實，G15、G10的分級范圍較小，僅能區分1 000 u以下的組分，對1 000～5 000 u之間組分的分離效果不佳，因此，本實驗最終選取G25填料作為多肽分離填料。

2.2 不同分子量多肽的風味評價

2.2.1 感官評價

按照表1中基本配方，分別稱取3.1中得到的＜1 000 u、1 000～5 000 u、＞5 000 u分子質量片段多肽以及未分離多肽、空白對比樣，與其他原料一同進行美拉德反應，取樣品進行感官評價及電子舌分析，結果見表4。

表4 肽粉反應產物的感官評價結果Table 4 Sensory evaluation results of reaction products of peptide powder

表4中評價結果顯示，3#樣品（分子質量＜1000u多肽的熱反應產物）在醇厚感、嗜好性方面優于其他樣品；2#樣品（分子質量1 000～5 000 u多肽的熱反應產物）在鮮度方面表現突出；1#樣品（分子質量＞5 000 u多肽的熱反應產物）在燉煮雞肉香味方面表現更接近于未分離的混合多肽樣品。可見，不同分子質量片段多肽提供的風味側重點不同，其中分子質量＜1 000 u以下部分嗜好性最優，故將其作為下一步實驗對象。

2.2.2 電子舌分析

圖1 電子舌主成分分析Fig.1 Principal component analysis of electronic tongue

由圖1可知，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的貢獻率之和達到了99.654%，能很好地反映樣品的實際情況。且全部樣品的主成分分析的識別指數為91，說明不同樣品能夠很好地區分開來。5#清水樣出現在圖中最左側，4#未分離酶解液樣品出現在圖中最右側，1～3#樣分布于其中，彼此差異明顯，即5個樣品風味差異較大。

表5 電子舌滋味強度分析Table 5 Analysis of taste intensity of electronic tongue

由表5可知，5個樣品的鮮味、甜味、酸味強度普遍較高，咸味和苦味強度普遍較低；其中2#樣品的鮮度最高，5個樣品的鮮度強度排序為2#＞4#＞3#＞1#＞5#，與感官評價結果一致。3#樣品的酸度最高；2#樣品的甜度最高。即1 000～5 000 u肽段的美拉德反應產物鮮度、甜度最優；小于1 000 u肽段的美拉德反應產物酸度最優，適宜的酸度可以增加肉味感，這可能是小于1 000 u肽段在感官評價中嗜好性最優的因素之一。

2.3 呈味肽的純化

利用反相高效液相色譜對嗜好性最優（分子質量＜1000u）的混合多肽樣品進一步純化，得到液相色譜圖見圖2，各峰保留時間及面積百分比見表6。

圖2 混合多肽樣品液相色譜圖Fig.2 LC chromatogram of mixed polypeptide samples

表6 各吸收峰保留時間及面積百分比Table 6 Retention time and area percentage of each absorption peak

由表6可知，多肽含量最多的色譜峰為5#、6#峰，利用高效液相色譜儀自帶的餾分收集器對5#、6#色譜峰進行收集，凍干后感官評價，評價結果顯示，6#峰在嗜好性、和諧性方面明顯優于5#峰，因此，以收集到的6#峰為研究對象，進一步進行分離與鑒定。

2.4 呈味肽的鑒定

利用液質聯用儀對呈味肽進一步進行分離及成分鑒定，可檢測到多種多肽，結合文獻報道的氨基酸、多肽呈味效果，選擇其中5條最有可能具有呈味貢獻的多肽進行下一步固相合成。5條多肽的一級結構分別為γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-L-Val-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，其質譜鑒定結果如圖3所示。

圖35 條呈味肽質譜圖Fig.3 Mass chromatogram of five flavor peptides

2.5 呈味肽的合成

目前，較為常用的多肽合成方法包括固相合成和液相合成法。相比于液相合成，固相合成法具有合成方便、迅速、純度高等優勢，已成為多肽合成的首選方法，為此，本實驗采用固相合成法進行呈味肽合成。

采用反相高效液相色譜儀對合成肽粗品進行純化，復凍干去除溶劑后即得多肽純品，純度由分析型高效液相色譜儀給出，均＞98%，產物可作為下一步風味驗證試驗的樣品。

2.6 呈味肽的呈味功能驗證

將合成的5條呈味肽以及目前報道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽（glutathione，GSH）進行清水評價，結果見表7。

由表7可知，合成的5條多肽，呈味效果基本以酸、甜、鮮味為主，這可能與其都以L-谷氨酸為氮端相關，而L-谷氨酸是典型的呈現酸味、鮮味的氨基酸。其中，γ-L-Glu-LVal-Gly與α-L-Glu-L-Val-Gly，這兩條多肽的氨基酸序列完全相同，其區別僅為谷氨酸與纈氨酸之間形成肽鍵的羧基位置不同，但兩者的呈味效果產生明顯差異，表現為γ位的L-Glu-L-Val-Gly酸度高，略鮮甜、入口后唇舌感受到明顯的收斂，而α位L-Glu-L-Val-Gly僅呈現較弱的酸味。由此可知，多肽的呈味功能不僅與其氨基酸序列相關，還與肽鍵的形成位置等空間結構相關。而化合物的空間結構直接影響其與味覺受體的結合與味覺響應，從而影響味感。

表76 種多肽感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of six poly peptides

由于不同呈味物質間的協同作用對呈味效果影響較大，單純的清水評價無法充分體現物質味味相乘的作用，因此配置雞粉溶液加香評價。合成的5條呈味肽與空白、谷胱甘肽對比評價結果見表8。

表86 種多肽的雞粉溶液加香評價結果Table 8 Sensory evaluation results of six poly peptides in chicken powder solutions

由表8可知，6條多肽中，谷胱甘肽由于本身含有含硫氨基酸-胱氨酸，相比于其他多肽，其呈現出的肉味最強；呈現鮮味最強的多肽為γ-L-谷谷肽和γ-L-谷纈氨甘肽；呈現醇厚感最強的多肽依次為谷胱甘肽、γ-谷纈甘肽，與文獻報道中γ-L-谷纈甘肽是L-谷胱甘肽醇厚感的12.8倍，是目前發現的醇厚感最強的多肽[28]不一致，可能與評價基質、多肽濃度、溶液pH有關，有待于今后進一步研究。

3 結論

本實驗采用酶解法以雞肉為原料進行雞肉蛋白多肽的制備，通過葡聚糖凝膠柱層析法對混合多肽進行不同分子質量片斷的分離，確定最優的分離填料為G25、洗脫液為乙醇-水，在此條件下，分子質量＜1 000 u組分含量可達100%、＞5 000 u含量達78%、1 000～5 000 u含量達70%。通過感官評價、電子舌分析發現，不同分子質量片段多肽提供的風味側重點不同，分子質量＜1 000 u的多肽熱反應產物在醇厚感、嗜好性方面最優。利用高效液相色譜、液質聯用儀對該肽段進一步純化與鑒定，找到其中5條呈味肽γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-LVal-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，并采用固相合成法制備，經感官評價驗證其呈味功能，發現在清水評價中，合成的5條多肽呈味效果以酸、甜、鮮味為主；在雞粉溶液加香評價中，呈現鮮味最強的多肽為γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈現醇厚感最強的多肽依次為L-GSH和γ-L-Glu-L-Val-Gly。同時，實驗證實多肽的呈味功能不僅與其氨基酸序列有關，還與肽鍵的形成位置等空間結構相關。多肽的氨基酸組成、序列以及空間結構與呈味之間的構效關系有待于進一步深入研究，以便為更多呈味肽的發現與應用，以及高品質香精、調味品的開發提供理論依據。

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Preparation,purification and identification of taste peptides

DENG Li,HAO Xuecai,LIU Na
(TianjinKeyLaboratoryofFlavorFoodIngredientsEnterprise,R&DCenter,TianjinChunfaBiotechnologyGroupCo.,Ltd.,Tianjin300300,China)

With chicken as raw material,the chicken protein polypeptides were prepared by enzyme hydrolysis method.According to the different molecular mass fragments,mixed polypeptides were separated by dextran gel column chromatography.The optimal separation filler was G25,the eluent was ethanol-water.Under the conditions,the content of components below molecular mass 1 000 u by separation and enrichment was up to 100%,above molecular mass 5 000 u up to 78%,and molecular mass 1 000-5 000 u up to 70%.The results of sensory evaluation and electronic tongue analysis showed that the polypeptides with different molecular mass fragments provided different taste profiles.The thermal reaction products of peptides that molecular mass was less than 1 000 u were superior in kokumi taste(mellow feeling)and preference.The polypeptides fragments were further purified and identified by HPLC and LC-MS.Five taste peptides were determined,and were prepared by solid-phase synthesis method.Their taste functions were verified by sensory evaluation.Results showed that the taste effect of five taste peptides synthesized was given priority to with sour,sweet and umami taste in the clear water evaluation.The peptides with strongest umami taste were γ-L-Glu-L-Glu and γ-L-Glu-L-Val-Gly,the peptides with strongest kokumi taste(mellow feeling)was L-GSH in the chicken powders solution evaluation

taste peptide;enzymatic hydrolysis;separation;purification;identification

TQ657

0254-5071（2017）04-0142-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.030

2017-01-19

鄧莉（1981-），女，工程師，碩士，主要從事咸味食品香精基礎研究工作。