煙曲霉酸的發酵培養基優化和反應器放大研究

徐帆，朱一翔，盧艷花*

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237）

煙曲霉酸的發酵培養基優化和反應器放大研究

徐帆，朱一翔，盧艷花*

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237）

煙曲霉酸是一種四環三萜類結構的化合物，具有良好的抗菌活性和抗癌效果。該研究在單因素試驗的基礎上，對來源于海洋的煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018發酵生產煙曲霉酸的培養基進行了優化及放大培養。結果表明，優化后發酵培養基為甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L，丁二酸鈉8.4 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。初始pH值調至4.2，搖瓶裝液量50 mL/250 mL，轉速160 r/min，28℃培養9 d。在此優化培養基及發酵條件下，煙曲霉酸的產量達到68.49 mg/L，為優化之前的4.1倍。并在此基礎上進行了5 L反應器的放大研究，在發酵第7天得到了煙曲霉酸的最大產量為54.81 mg/L。該實驗為HA生產的放大制備與應用推廣打下了基礎。

煙曲霉酸；煙曲霉；發酵培養基；優化；反應器放大

煙曲霉酸（helvolic acid，HA）是煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）次級代謝得到的四環三萜結構類化合物，有著良好的抗菌活性。通過與青霉素、紅霉素、四環素共同使用，能夠對金黃色葡萄球菌等多藥物抵抗的強力細菌展現有效的抑菌活性[1-4]。另一方面，HA對于癌細胞HeLa和HepG2的生長也展現出了抑制效果。這種抗菌和抗癌的生物活性使HA有著很高的藥用潛力[5]。但是，較低的HA產量限制了它的研究和應用推廣。根據之前的文獻報道，通過煙曲霉菌CY018液態發酵得到的HA最高產量僅為16.88 mg/L[6]。因此，需要通過優化HA的發酵培養基來提高產量，并進行工藝的放大探索。

根據目前提高HA產量的研究報道，WUQ等[6]通過一株來源于海洋的海蟹共生菌煙曲霉菌CY018，研究產HA和煙曲霉文丙的共同發酵條件優化。但是，這兩種次級代謝產物在代謝途徑中有一部分相同的代謝步驟，這表明這兩種產物的合成是存在競爭關系的。并且，之前的研究只在搖瓶水平進行實驗，但HA的規模化制備是建立在反應器放大研究的基礎上的。因此，目前缺少針對HA的發酵條件優化與反應器放大研究。

在發酵的過程中，發酵培養基對于優化發酵產量很重要。傳統的研究方法僅通過單因素試驗優化培養基，但是這種方法并不高效，并且無法考慮多因素優化過程中各因素之間的相互作用[7]。數理統計法（statistic methods）在處理多因素優化時非常高效[8]。通過Plackett-Burman試驗設計，能快速從大量因素中篩選出顯著性的因素[9]。通過最陡爬坡試驗（path of steepest ascent）找出各關鍵因素最適合的濃度范圍[10]。但是這兩種方法僅考慮了一階效應，并沒有涉及各因素的相互作用。為了克服這些限制，采用響應面法（response surface methodology，RSM），研究各因素及其交互作用，進行回歸分析優化工藝過程參數，進而反映出關鍵變量的貢獻度并預測相應的影響規律[11]。

本實驗以高產HA的菌株海蟹共生菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）CY018為研究對象，采用單因素試驗優化培養基中的碳氮源，得到合適的培養基組分后，通過Plackett-Burman試驗設計找出顯著性因素，通過最陡爬坡試驗找出最優濃度范圍，再運用Box-Behnken試驗設計優化HA的發酵培養基。在完成搖瓶水平的優化之后，在5 L反應器中進行了HA規模化發酵過程的初步探索，為今后HA的放大制備與應用推廣打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甲醇、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國TEDIA有限公司；Antifoam 204消泡劑：美國Sigma有限公司；HA標準品（純度＞95%）：南京大學譚仁祥教授提供；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 菌株

本研究所采用的HA高產菌株為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018，由南京大學課題組篩選并提供，菌種的保藏號為CGMCC No.1371。

1.1.3 培養基

活化培養基：稱取200g馬鈴薯，粉碎后加水煮沸30min，用八層紗布過濾后收集濾液，加10 g葡萄糖，1.5 g硫酸鎂，3 g磷酸二氫鉀，0.05 g維生素B1，加水補足至1 000 mL，分裝后加入2%的瓊脂，121℃滅菌15 min，備用。

種子培養基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏2.5g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，維生素B10.05 g/L。分裝后121℃滅菌15 min，備用。

基礎發酵培養基：甘露醇50 g/L，丁二酸鈉5.4 g/L，硝酸鈉2 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。pH調至4.2，分裝后121℃滅菌15 min，備用。

1.2 儀器與設備

SHJ-JP超凈工作臺：上海凈化設備廠；SCL-10AVP高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）：日本島津公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美國安捷倫科技公司；ZD-9556水平搖床：太倉市教科器材廠；Centrifuge 5415R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子培養與發酵條件

將煙曲霉菌（A.fumigatus）CY018接到活化培養基，在28℃的條件下培養5 d，加入50 mL種子培養基和約15顆無菌小玻璃珠，輕微振蕩，讓菌體懸浮均勻，把2 mL的懸浮液移入到裝液量為50 mL/250 mL的種子培養基中，搖床轉速為160 r/min，在28℃的條件下培養36 h。將種子液以10%（V/V）的接種量接入發酵培養基中，搖床轉速為160 r/min，28℃條件下發酵9 d。

1.3.2 建立HA的HPLC檢測方法

樣品預處理：將發酵液抽濾，收集菌體和發酵液。將菌體置于60℃烘箱內干燥至恒質量，稱量干質量后加入研缽碾磨以破碎細胞，加入發酵液中，用等體積的乙酸乙酯萃取2遍，將有機相收集于離心管中。將萃取液裝入250mL圓底燒中，在45℃的條件下減壓蒸發，然后加入10 mL的甲醇超聲溶解，取2 mL溶解液于EP管中，在轉速13 000 r/min條件下離心，取上清液至2mLEP管中，保存于4℃冰箱待測。

HA標準溶液制備：用天秤準確稱量HA標準品1.3 mg，加入1 mL甲醇溶解，然后稀釋10倍，用微孔濾膜過濾，測定制作HA標準曲線。

洗脫條件：A相為體積分數0.1%的三氟乙酸水溶液，B相為純乙腈。采用梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures of mobile phase

檢測條件：紫外檢測檢測器的檢測波長230 nm，柱溫箱溫度：30℃，流速：1 mL/min。

1.3.3 發酵過程中參數的測定

通過測定菌體干質量（dry cell weight，DCW）來判斷煙曲霉菌CY018的生長狀態，通過比色法測定殘糖量（甘露醇）[12]，以了解發酵過程中碳源的消耗水平。通過pH電極測定發酵液的pH。通過溶氧電極測定發酵液的溶氧量（dissolved oxygen，DO）。

1.3.4 發酵培養基優化單因素試驗

氮源的確定：在基礎培養基中添加了4種有機氮源（添加量均為3 g/L的蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、玉米粉），在種子培養36 h之后，以10%的接種量接入到發酵培養基，搖床的轉速為160 r/min，pH調整為4.2，在28℃的條件下發酵9 d，測定發酵液中HA的產量。

碳源的確定：把基礎培養基的甘露醇替換為不同的碳源（添加量均為34 g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖），在種子培養36 h之后，以10%的接種量接入到發酵培養基，搖床的轉速為160 r/min，pH調整為4.2，在28℃的條件下發酵9 d，測定發酵液中HA的產量。

1.3.5 響應面法優化發酵培養基

（1）Plackett-Burman試驗

通過Design Expert 8設計Plackett-Burman試驗來篩選能影響HA產量的顯著性因素。試驗設計的因素包括甘露醇（A）、硝酸鈉（B）、硫酸鎂（C）、硫酸亞鐵（D）、磷酸二氫鉀（E）、丁二酸鈉（F）和牛肉浸膏（G）添加量。分別對各個因素設置高水平和低水平添加量，以發酵結束后HA的產量（Y）為評價指標，Plackett-Burman試驗因素與水平見表2。

表2Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

（2）最陡爬坡試驗

通過Placket-Burman試驗找出的顯著性因素后，采用最陡爬坡試驗找出HA產量最高的數據作為之后優化的最優范圍。

（3）Box-Behnken響應面試驗

根據最陡爬坡試驗所選出的最優中心范圍，通過Design Expert8軟件，以最陡爬坡試驗確定的中心點為中間水平，對于每個試驗因素設置3個水平進行考察，設計Box-Behnken響應面試驗優化HA的產量。

1.3.6 反應器放大研究

在完成了數理統計優化后，進行5L反應器的發酵試驗，初步探索工藝放大。在5 L反應器中填裝3 L發酵培養基，加入0.5%（V/V）的Antifoam 204消泡劑。將種子液以10%（V/V）的接種量接入，初始pH值調整為4.2，通氣量為6L/min，攪拌速率設定為300 r/min，發酵溫度設置為28℃。在5 L反應器發酵過程中觀察發酵液的pH、菌體干質量（DCW）、殘糖量、溶氧量（DO）。同時，也進行了搖瓶水平的代謝曲線研究，以比較反應器放大發酵過程與搖瓶發酵的差異。

2 結果與分析

2.1 氮源與碳源對HA產量的影響

試驗研究了4種有機氮源及6種碳源對煙曲霉菌CY018發酵產HA的影響，結果見圖1。由圖1A可知，與其他氮源相比，牛肉膏對于煙曲霉菌的生物量積累和HA的產量效果最好。這可能是由于相比于其他氮源，牛肉膏這類復雜氮源能提供更多的營養元素[13]，適合菌體的生長和代謝[14]。除了氮源以外，碳源也參與到細胞生長，細胞組分形成，提供能量與合成代謝物[15]。由圖1B可知，與其他碳源相比，添加甘露醇的培養基得到了最高的HA產量。這可能是由于甘露醇是一種緩釋碳源，有利于次級代謝產物的積累[16]。可溶性淀粉不利于菌體生長和HA的積累，這可能是由于真菌較難分解利用大分子質量的碳水化合物[17]。

圖1 不同氮源(A)及碳源(B)對煙曲霉酸產量的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources(A)and carbon sources(B) on helvolic acid production

2.2 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設計及結果見表3，采用方差分析來分析試驗數據，結果見表4。由表4可知，該模型的F值為17.17且P值為0.007 7＜0.01，表明該模型極顯著，且決定系數R2為0.967 8，校正決定系數R2adj為0.911 4，表示該響應方程可以為Plackett-Burman試驗的提供合適的模型。試驗的精確度以變異系數（variation coefficient，CV），CV值越低，表明試驗的可靠性越高，設計試驗中的CV=2.75%，說明實驗結果可信[18]。甘露醇及牛肉浸膏對HA的合成顯示了極顯著的影響（P＜0.01），硝酸鈉對HA的合成顯示了顯著的影響（P＜0.05），其他因素對HA的合成無顯著的影響。該結果證實氮源與碳源對煙曲霉菌CY018發酵制備HA起到了很大的作用[19]。在測試的7種因素中，Na2C2O4對HA的產量呈現了正效應，甘露醇、硝酸鈉與牛肉浸膏等其他因素呈現出負效應。根據這一結果，選擇甘露醇，硝酸鈉與牛肉膏這三種因素進行下一步的優化。

表3Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

2.3 最陡爬坡試驗

據Plackett-Burman試驗篩選出的3個顯著性因素（甘露醇，硝酸鈉與牛肉浸膏），通過最陡爬坡試驗來尋找合成HA的培養基各因素的最優范圍。由于甘露醇，硝酸鈉以及牛肉浸膏均對HA的合成呈現出負效應，因此將3種因素的添加量按照遞減的順序設計最陡爬坡試驗，試驗的設計及結果見表5。

由表5可知，在第2組爬坡梯度中（甘露醇42.5 g/L，硝酸鈉2.5 g/L，牛肉浸膏3.75 g/L）得到了最高的HA產量65.8mg/L，說明這一組添加水平已經最接近于HA合成曲面的最高值。因此，將這一組添加水平作為之后Box-Behnken試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

2.4 Box-Behnken響應面試驗

根據最陡爬坡試驗找到的最優中心范圍，用軟件Design Expert 8設計了3種顯著性因素的Box-Behnken響應面試驗，因素編碼水平見表6，試驗設計及結果見表7。

表6Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 6 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表7Box-Behnken試驗設計及結果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

采用Design Expert 8軟件對表7試驗結果進行多重回歸分析，得到了關于HA產量（Y）的擬合二次多項式模型方程如下：

Y=+61.21-2.71×A-2.12×B+2.05×G-2.63×A×B+1.34×A× G+1.94×B×G-4.51×A2+2.75×B2-0.63×G2

根據試驗的數據，采用F-test來評估了方差分析模型的數據顯著性，得到的F值為8.91，P值為0.004 4＜0.05，表示方程具有顯著性。甘露醇、NaNO3、牛肉浸膏這三個因素的P值分別為的0.012 6，0.013 8，0.016 2，均＜0.05，說明該試驗研究的因素均已經達到了顯著差異水平。試驗的信噪比為11.231＞4，表示該模型具有足夠的信號[20]。模型決定系數R2為0.919 7，表示在該響應面內有91.97%的變異性可以用此多項式方程進行描述[21]，說明該模型可以用來分析預測煙曲霉菌CY018發酵產HA的量。

為了更直觀的理解各因素對HA產量的影響，并獲得最優的培養基組合，使用DesignExpert8軟件獲得了二次方程的三維響應面及等高線，結果見圖2。

圖2 甘露醇、硝酸鈉及牛肉浸膏添加量交互作用對煙曲霉酸產量影響的響應面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mannitol,sodium nitrate and beef extract addition on helvolic acid production

根據軟件的預測結果，當培養基中3種因素添加量分別為甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L時，預測的HA最高產量能達到67.53 mg/L。

2.5 響應面優化試驗驗證

為了驗證HA產量擬合方程的最優化預測結果，采用優化后的培養基進行了3次發酵，得到的HA平均產量為68.49 mg/L，與67.53 mg/L的預測值僅相差1.42%，證明了Box-Behnken響應面試驗設計的有效性，該數據模型能準確的預測HA的產量。相比于最初的發酵水平，培養基優化后HA產量達到了原先的4.1倍。

2.6 反應器放大

在優化發酵培養基的基礎上進行了搖瓶水平和5 L反應器水平的發酵，以比較兩種培養條件下菌體發酵的差異。在發酵的過程中記錄兩者的發酵參數。搖瓶及5 L反應器水平的代謝曲線見圖3。

圖3 搖瓶(A)及5 L反應器(B)水平煙曲霉菌發酵生產煙曲霉酸的代謝曲線Fig.3 Metabolism curves ofAspergillus fumigatusfermentation for helvolic acid production in shake flask(A)and 5 L bioreactor(B)

由圖3可知，相比于搖瓶，5 L反應器中菌體生長更快，DCW在發酵的第72小時就達到了14.15 g/L。這可能是由于反應器中更好的傳質效果和供氧。搖瓶和反應器中都在第144小時檢測到了HA，這表示煙曲霉菌在從對數生長期進入到穩定期時開始合成HA。反應器中的HA產量在第168小時（第7天）達到了最高值54.81 mg/L。這可能是由于曲霉真菌次級代謝受到氧化應激所調控[22]，而5 L反應器中有更充足的供氧水平，抑制了HA的合成積累。

5 L反應器與搖瓶水平發酵液中殘糖的消耗與菌體生長曲線均呈現了一定的相關性。當菌體生長進入了穩定期，殘糖的消耗速度減緩，此時的殘糖消耗可能是用于維持菌體以及次級代謝產物的合成積累。在第216小時，發酵液中的殘糖基本消耗完全，此時生物量下降，表明煙曲霉菌開始自溶。同時，發酵液中的HA濃度也開始降低，這可能是由于殘糖耗盡后菌體開始分解次級代謝產物來維持菌體自身。

5 L反應器與搖瓶水平的發酵液pH在發酵的過程中總體逐步提升，這可能是由于氮源的持續消耗和氨根離子的釋放[23]。DO值在發酵早期快速下降，利于菌體的快速生長[24]。在菌體生長進入穩定期后，菌體只需要維持自身的生理需求，所以DO值達到穩定。

3 結論

本實驗進行了煙曲霉菌CY018發酵生產HA的培養基優化和初步放大探索。通過數理統計方法優化培養基后，將HA的產量提高到了68.49 mg/L，為基礎培養基的4.1倍。優化后的搖瓶發酵培養基為：甘露醇39.88 g/L，硝酸鈉2.25 g/L，牛肉膏3.54g/L，丁二酸鈉8.4g/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，磷酸二氫鉀0.67 g/L。將優化后的培養基應用于5 L反應器進行發酵，得到了HA的最高產量為54.81 mg/L，為HA的放大制備進行了初步的探索。

[1]ZHAO J L,MOU Y,SHAN T J.Antimicrobial metabolites from the endophytic fungusPichia guilliermondiiisolated fromParis polyphyllavar. Yunnanensis[J].Molecules,2010,15(11):7961-7970.

[2]VENDITTIS E D,PAOLA B D,GOGLIETTINO M A,et al.Fusidic and helvolic acid inhibition of elongation factor 2 from the archaeonSulfolobus solfataricus[J].Biochemistry,2002,41(50):14879-14884.

[3]KILDGAARD S,MANSSON M,DOSEN I,et al.Accurate dereplication ofbioactive secondarymetabolitesfrom marine-derived fungi byUHPLCDAD-QTOFMS and a MS/HRMS library[J].Marine Drug,2014,12(6): 3681-3705.

[4]QIN L,LI B,GUAN J,et al.In vitrosynergistic antibacterial activities of helvolic acid on multi-drug resistantStaphylococcus aureus[J].Nat Prod Res,2009,23(4):309-318.

[5]YING D,XIAO J H,XIA X X,et al.Effect of oxygen supply on biomass and helvolic acid production in submerged fermentation ofCordyceps taii[J].Biochem Eng J,2013,81:73-79.

[6]WU Q,SONG Y C,XU H,et al.Medium optimization for enhanced coproduction of two bioactive metabolites in the same fermentation by a statistical approach[J].J Asian Nat Prod Res,2011,13(12):1110.

[7]KAMMOUN R,NAILI B,BEJAR S,et al.Application of a statistical design to the optimization of parameters and culture medium for α-amylase production byAspergillus oryzaeCBS 819.72 grown on gruel(wheat grinding by-product)[J].Bioresource Technol,2008,99(13):5602-5609.

[8]WEI Z H,DUAN Y Y,QIAN Y Q,et al.Screening ofGanodermastrains with high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statistical methods[J].Bioproc Biosyst Eng,2014,37(9):1789-1797.

[9]ISA N K,MAT D M.Investigation of the gibberellic acid optimization with a statistical tool fromPenicilliumvariable in batch reactor[J].Prep Biochem Biotechnol,2014,44(6):572-585.

[10]陳羽，徐威，位星.響應曲面法優化Gluconobacter melanlgenu X42培養基[J].微生物學雜志，2016，36（4）：67-70.

[11]褚沖，姚尚杰，黃鈞.中心組合設計優化野葛糖化工藝[J].中國釀造，2016，35（9）：145-149.

[12]BOK S H,DEMAIN A L.An improved colorimetric assay for polyols [J].Anal Biochem,1977,81(1):18-20.

[13]SREEKANT M S,VIJAYENDRA S V,JOSHI G J,et al.Effect of carbon and nitrogen sources on simultaneous production of α-amylase and green food packaging polymer byBacillussp.CFR 67[J].J Food Sci Technol,2013,50(2):404-408.

[14]LI P T,HSIAO W L,YU R C,et al.Effect of heat shock on the fatty acid and protein profiles ofCronobacter sakazakiiBCRC 13988 as well as its growth and survival in the presence of various carbon,nitrogen sources and disinfectants[J].Food Microbiol,2013,36(2):142-148.

[15]THAPA L P,LEE S J,YANG X G,et al.Co-fermentation of carbon sources byEnterobacter aerogenesATCC 29007 to enhance the production of bioethanol[J].Bioproc Biosyst Eng,2014,37(6):1073-1084.

[16]KOZLOVSKY A,ZHELIFONOVA V,ANTIPOVA T.The influence of medium composition on alkaloid biosynthesis byPenicillium citrinum [J].Appl Biochem Microbiol,2010,46(5):572.

[17]HELLIN P,ROS J M,LAENCINA J.Changes in high and low molecular weight carbohydrates duringRhizopus nigricanscultivation on lemon peel carbohydrate[J].Carbohyd Polym,2001,45(2):169-174.

[18]李志華.基于PB試驗和響應面分析法對谷氨酸棒桿菌CN1021發酵培養基優化[J].中國釀造，2014，33（2）：23-27.

[19]ZHU Y P,LI X T,TENG C,et al.Enhanced production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain ofBacillus subtilisB2 using responsesurfacemethodology[J].Food Bioprod Proc,2013,91(3):264-270.

[20]WANG X,BAI C,ZHANG J.Improving the mda-7/IL-24 refolding and purification process using optimized culture conditions based on the structure characteristics of inclusion bodies[J].Bioresource Bioproc, 2014,1(1):21.

[21]李亞輝，馬艷弘，黃開紅.藍莓發酵酒澄清和冷穩定處理的響應面優化[J].中國釀造，2015，34（2）：126-130.

[22]劉少文，柏凡，郭春華，等.黃曲霉次級代謝的分子機制研究進展[J].飼料研究，2015（9）：9-13.

[23]ABDOUN K,WOLF K,MARTENS H.Interaction between ammonia, sodium and chloride transport across the rumen epithelium in sheep[J]. Small Rumin Res,2006,63(1-2):91-99.

[24]WANG Y H,FANG X L,LI Y P,et al.Effects of constant and shifting dissolved oxygen concentration on the growth and antibiotic activity of Xenorhabdus nematophila[J].Bioresource Technol,2010,101(19): 7529-7536.

Optimization of fermentation medium for helvolic acid production and reactor scale-up study

XU Fan,ZHU Yixiang,LU Yanhua*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Department of Bioengineering,East China University of Science&Technology, Shanghai 200237,China)

Helvolic acid is a kind of tetracyclic triterpenoids,which shows effective antimicrobial activity and anticancer effect.On the basis of single factor experiment,the medium for marine derivedAspergillus fumigatusCY018 culture for helvolic acid production was optimized,and scale-up fermentation was studied.The optimal fermentation conditions were obtained as follows:mannitol 39.88 g/L,NaNO32.25 g/L,beef extract 3.54 g/L, Na2C2O48.4 g/L,MgSO40.3 g/L,FeSO40.01 g/L,KH2PO40.67 g/L.The optimal fermentation condition was initial pH 4.2,rotation liquid volume 50 ml/250 ml,shake speed 160 r/min,temperature 28℃for 9 d.Under the optimal condition,the yield of helvolic acid could achieve 68.49 mg/L, which was 4.1 times of the yield before optimization.The study of 5 L bio-reactor was conducted,and the maximum helvolic acid production of 54.81 mg/L was achieved in 7 d,which laid foundation for helvolic acid preparation and application.

helvolic acid;Aspergillus fumigatus;fermentation medium;optimization;reactor scale-up

TQ920.6

0254-5071（2017）04-0131-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.028

2017-02-13

國家‘863’計劃項目（2013AA092901）；生物反應器工程國家重點實驗室國家重點基金（2060204）

徐帆（1990-），男，碩士研究生，研究方向為生物發酵。

*通訊作者：盧艷花（1968-），女，教授，博士，研究方向為生物工程技術在中藥現代化中的應用。