黑曲霉利用紅薯粉生產檸檬酸的發酵條件研究

徐艷

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

黑曲霉利用紅薯粉生產檸檬酸的發酵條件研究

徐艷

（荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000）

對黑曲霉利用紅薯粉生產檸檬酸的發酵條件進行優化。采用單因素試驗考察發酵時間、培養基紅薯粉含量、搖床轉速、初始pH對檸檬酸產量的影響。在單因素試驗的基礎上，利用正交試驗確定黑曲霉利用紅薯粉生產檸檬酸的發酵條件為：發酵時間60 h、培養基紅薯粉含量40 g/L，搖床轉速200 r/min，初始pH值6.0。在此條件下，檸檬酸產量達4.81 g/L。

黑曲霉；檸檬酸；發酵條件

檸檬酸被稱為第一食用酸味劑，在食品工業上極廣泛地用作酸味劑、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、螯合劑等[1]。檸檬酸的生產方法主要有三大類，一是用萃取、吸附、膜分離、工業色譜等分離純化的方法從檸檬、橙等水果中提取；二是以草酰乙酸與乙烯酮為原料的合成；三是發酵法。提取法單元操作繁瑣、提取效率普遍偏低，且需要大量的輔料，還存在廢水排放等問題[2-3]。化學合成方法工藝流程復雜，設備和成本要求高，且安全性又很低，因而并不是主流的生產檸檬酸方法。發酵法工藝簡單，生產效率高，成本低，無污染，是目前國內外工業生產采用的方法[4-6]。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一類在自然界廣泛存在的腐生真菌，多見于土壤、糧食、藥材、蟲體、枯枝落葉、動物糞便、霉腐物等中。黑曲霉是重要的工業微生物，可以發酵生產有機酸、淀粉酶、纖維素酶等[7]。黑曲霉對發酵條件要求較低，生長迅速，對培養基原料適應性強，并且產量穩定，當前99%的檸檬酸產出于黑曲霉發酵[8]。紅薯大約含有20%的淀粉，制成干粉的紅薯可直接進行深層發酵產檸檬酸[9-11]。李忠英[12]對產檸檬酸黑曲霉初始含糖量、發酵溫度、發酵時間、起始pH、轉速等發酵條件進行了優化試驗。

目前，我國是世界上最大的檸檬酸生產國和出口國，檸檬酸的發酵技術也處在世界先進水平，用于食品加工的檸檬酸接近70%，在國內，由于不含酒精飲料對檸檬酸的需求較大，市場需求每年以3%～5%的速度增長。我國種植紅薯面積廣泛，薯類資源豐富，加之黑曲霉菌種適應性很好，對原料的要求低，生產產量相對比較穩定，薯類發酵的條件要求比較低，不需額外添加含氮化合物、無機鹽以及其他促進產酸的試劑即可進行。將紅薯制成干粉后發酵產生檸檬酸，一方面可以減少固體物料的處理量，使之易于操作，另一方面還可以綜合利用這些作物的其他組分。紅薯相較于其他薯類，在產酸率和轉化率方面有一定的優勢。

本研究在分析單因素對紅薯粉發酵產生檸檬酸影響的基礎上，進行正交試驗，研究各因素綜合對產生檸檬酸的影響，以期為檸檬酸的生產提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003：中國食品藥品檢定研究院。

紅薯粉：興化市綠咖園食品有限公司。

1.1.2 試劑

α-高溫淀粉酶（5萬U/mL）：湖南省新鴻鷹生物工程有限公司；葡萄糖（純度99.5%）：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂：北京奧博星生物技術責任有限公司；氫氧化鈉（NaOH）、亞硝酸鈉（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠；磷酸二氫鉀（分析純）：河南焦作市化工三廠；硫酸鎂（分析純）：天津化學試劑一廠；氯化銨（分析純）：天津市泰興試劑廠。

1.1.3 培養基

斜面活化培養基：葡糖糖30.0 g，NH4Cl 3.0 g，KH2PO41.0 g，瓊脂15.0 g，加入1 L超純水中煮至微沸，待完全溶解后冷卻至50℃左右分裝，備用。

液體種子培養基：葡萄糖30.0 g，NaNO33.0 g，KH2PO41.0 g，加入1 L超純水中煮至微沸，待完全溶解后冷卻至室溫，調節pH值至6.0分裝，冷藏備用。

紅薯粉發酵培養基：紅薯粉50 g（過20目篩），葡萄糖50 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加超純水至1 000 mL，調節pH值為6.0，按10 U/g原料加入α-高溫淀粉酶，攪拌至均勻，加熱至微沸，保持15 min，待冷卻后用0.1%碘液檢測不顯藍色即為糖化完全。四層紗布過濾后于立式滅菌鍋徹底滅菌，冷藏備用。

1.2 儀器與設備

AB145-S電子天平：上海上天精密儀器有限公司；DH-600恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司；YXQ-LS-50SII立式滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；RH-QW恒溫搖床：金壇市天竟實驗儀器廠；SW-CJ-JF單人雙面凈化工作臺：蘇州金凈科技有限公司；SHZ-DIII真空抽濾泵：上海予華儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與擴大培養

將黑曲霉在無菌條件下用接種環挑取少許，均勻接種在斜面培養基上，于恒溫培養箱中35℃培養3 d，至斜面長滿黑色孢子從而制得斜面菌種，4℃冷藏備用。

無菌條件下挑取少許活化的黑曲霉菌種于液體種子培養基，35℃恒溫搖床培養，直至長出分布均勻的球狀菌落（不宜過大，否則后期發酵菌種分布不均），4℃冷藏備用[12]。

1.3.2 紅薯粉糖化

配制1 L培養基：稱取紅薯粉50 g過20目篩，用蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH值為6.0，按10 U/g原料加入α-高溫淀粉酶，攪拌均勻后加熱至微沸，保持15 min，冷卻后用0.1%碘液檢測，不顯藍色即為糖化完全。過濾后徹底滅菌，4℃冷藏備用[13]。

1.3.3 檸檬酸產量測定

將發酵后的發酵液過濾，棄去濾渣，取5 mL發酵液于50mL錐形瓶中，加入2滴酚酞指示劑后搖勻，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，至溶液剛好變色，且半分鐘紅色不褪去。記下消耗的NaOH溶液的體積，重復進行3次試驗，取平均值[12-13]。檸檬酸產量計算公式如下：

式中：n為檸檬酸產量，g/L；c為NaOH溶液的濃度，mol/L；M為檸檬酸的分子質量，g/mol；V為消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；1 000為體積換算倍數；3為滴定時一分子檸檬酸消耗3分子NaOH。

1.3.4 單因素試驗

選取黑曲霉發酵條件過程中4個關鍵因素，即發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h）、培養基紅薯粉含量（35g/L、40g/L，45g/L、50g/L、55g/L和60g/L）、初始pH（5.2、5.6、6.0、6.4、6.8和7.2）和搖床轉速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min和500 r/min）進行單因素試驗，考察這4個因素對檸檬酸產量的影響。

1.3.5 正交試驗[14-15]

根據單因素試驗結果，以檸檬酸產量為評價指標，進行L9（34）正交試驗設計，從而優化黑曲霉利用紅薯粉生產檸檬酸的發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 黑曲霉產檸檬酸發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

2 結果與分析

2.1 發酵時間對黑曲霉利用紅薯粉產檸檬酸的影響

圖1 發酵時間對檸檬素產量的影響Fig.1 Effects of fermentation time on citric acid yield

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，檸檬酸產量呈先增加后趨于平穩的趨勢，在48 h之前，黑曲霉處于調整期與對數生長期主要表現為適應環境，大量繁殖，檸檬酸產量較少；當黑曲霉發酵48 h后，檸檬酸產量上升的趨勢明顯減緩，說明黑曲霉在48 h左右達到平穩期。而48 h左右黑曲霉達到平穩期，開始大量積累檸檬酸。在48 h之后，檸檬酸的產量雖然一直維持穩定，但是由于菌種的大量繁殖，消耗的營養物質也會迅速增加，發酵周期也過長，因此，選擇48 h為最佳的發酵時間。

2.2 培養基紅薯粉含量對黑曲霉產檸檬酸的影響

圖2 培養基紅薯粉含量對檸檬酸產量的影響Fig.2 Effects of medium sweet potato powder contents on citric acid yield

由圖2可知，隨著培養基紅薯粉含量的增加，檸檬酸的產量先上升后稍有下降，再逐漸趨于平穩。當紅薯粉含量＜40 g/L時，黑曲霉生長受到抑制，不能繁殖足夠多的菌體，菌體濃度偏低，導致產酸量偏低；當紅薯粉含量＞40 g/L，黑曲霉菌體濃度過大，產物合成受到抑制，生產速率反而下降。因此，選擇培養基紅薯粉含量40 g/L為宜。

2.3 初始pH對黑曲霉利用紅薯粉產檸檬酸的影響

圖3 初始pH對檸檬酸產量的影響Fig.3 Effects of initial pH on citric acid yield

由圖3可知，隨著培養基中初始pH增大，檸檬酸產量先上升后下降。當初始pH值為5.2～6.4時，檸檬酸產量逐漸增加；當初始pH值為6.4時，黑曲霉利用紅薯粉產檸檬酸量達到最大，為4.02 g/L；當初始pH值＞6.4時，檸檬酸產量開始下降。培養基中初始pH值過高或過低時，菌體內的酶活性普遍受到抑制，酶活力活力下降導致其催化的反應速率下降；高的H+或OH-濃度還會改變基質或中間產物的解離度，改變膜的通透性，使代謝的速率減緩。因此選擇初始pH6.4為宜。

2.4 搖床轉速對黑曲霉產利用紅薯粉檸檬酸的影響

圖4 搖床轉速對檸檬酸產量的影響Fig.4 Effects of shaking rotate speed on citric acid yield

由圖4可知，檸檬酸的產量隨著搖床轉速的增加而迅速變大，當搖床轉速＞200 r/min時；黑曲霉的產檸檬酸量趨于穩定，無明顯增加。說明培養基達到一定轉速后，滿足了黑曲霉生長所需的氧氣量。因此選擇搖床轉速200 r/min為宜。

2.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，進行黑曲霉利用紅薯粉產檸檬酸發酵條件優化正交試驗，結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 黑曲霉產檸檬酸發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

由表2可知，RA＞RC＞RB＞RD，4種因素對檸檬酸產量影響大小依次為發酵時間（A）＞初始pH（C）＞培養基紅薯粉含量（B）＞搖床轉速（D）。

根據K值可知，最佳因素組合為A2B1C2D1，即發酵時間60 h，發酵培養基紅薯粉含量為40 g/L，發酵培養基初始pH值為6.0，搖床轉速為200 r/min，在此發酵條件下進行3次驗證試驗，檸檬酸的產量平均值為4.81 g/L，高于正交試驗各組的產量。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，4個因素都對黑曲霉利用紅薯粉發酵產檸檬酸有極顯著的影響（P＜0.01），4個因素影響的主次順序為發酵時間（A）＞初始pH（C）＞培養基紅薯粉含量（B）＞搖床轉速（D），與極差分析結果一致。

3 結論

本試驗以紅薯粉為原料，采取黑曲霉發酵法制取檸檬酸。對紅薯粉利用紅薯粉產檸檬酸的發酵條件進行了研究。通過單因素試驗和正交設計試驗，得出黑曲霉利用紅薯粉發酵產檸檬酸的最佳條件為發酵時間60 h、發酵培養基紅薯粉含量40 g/L，搖床轉速200 r/min，發酵培養基初始pH 6.0。在此條件下，檸檬酸產酸量可達4.81 g/L。

目前國內市場對檸檬酸的需求較大，而我國紅薯產量高，本研究將紅薯制成干粉后發酵產生檸檬酸，能夠對農產品利用提供新的途徑，為檸檬酸的生產提供一定的依據。

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Fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder

XU Yan
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

The fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder were optimized.The effects of fermentation time,sweet potato powder content in medium,shaking rotate speed and initial pH on citric acid yield were investigated by single factor experiments.On the basis of single factor experiments,the fermentation conditions were determined as time 60 h,sweet potato powder content 40 g/L, shaking rotate speed 200 r/min and initial pH 6.0 by orthogonal experiments.Under the conditions,the citric acid yield was up to 4.81 g/L.

Aspergillus niger;critic acid;fermentation conditions

TS261.12

0254-5071（2017）04-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.027

2016-11-25

荊楚理工學院新農村研究項目（2016Z002）

徐艷（1981-）女，講師，碩士，研究方向為植物資源開發與利用。