分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子濃度的研究

袁洪威，陳湖芳，高東民，劉學(xué)策，郭博愷，李祝*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550025）

分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子濃度的研究

袁洪威1，陳湖芳1，高東民1，劉學(xué)策1，郭博愷2，李祝1*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)550025）

采用分光光度計(jì)測(cè)定黑曲霉（Aspergillus niger）xj在不同生長(zhǎng)期、不同稀釋倍數(shù)下孢子懸液的OD600nm值，對(duì)比血球板計(jì)數(shù)法得到的孢子懸液濃度，研究在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期OD600nm值與孢子濃度之間的關(guān)系；采用微電影拍攝法觀察黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成過程，并繪制固體發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，在10～20倍稀釋區(qū)間內(nèi)，稀釋倍數(shù)與OD600nm值之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（對(duì)數(shù)期R2=0.984 8、穩(wěn)定期R2=0.991 3），且OD600nm值與孢子濃度之間也保持良好的線性關(guān)系（對(duì)數(shù)期R2=0.995 3、穩(wěn)定期R2=0.993 6）；通過微電影拍攝法觀察到黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成是分階段進(jìn)行的過程；在固體發(fā)酵過程中，孢子濃度呈現(xiàn)“S”型增長(zhǎng)趨勢(shì)。該研究為測(cè)定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

分光光度法；黑曲霉；孢子濃度；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；生長(zhǎng)曲線

黑曲霉（Aspergillus niger）屬于半知菌類曲霉屬[1]，是曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。黑曲霉作為一種潛在的生防菌劑，對(duì)于由齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的超過500種植物（如大麥、豇豆、辣椒、花生和大豆[2-6]等）病害有良好的抑制效果。此外，黑曲霉作為一種優(yōu)良的工業(yè)菌株，在食品加工和代謝物（如有機(jī)酸和抗菌素）提取方面有廣泛應(yīng)用[7-10]。目前，在黑曲霉的開發(fā)和利用方面取得了顯著的成果，吳鵬等[12]利用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)和Box-Behnken（BB）試驗(yàn)對(duì)黑曲霉HS-5產(chǎn)β-葡萄糖酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使β-葡萄糖酶產(chǎn)率提高了5.91倍。這就要求對(duì)其生長(zhǎng)過程中菌體的生長(zhǎng)變化，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成狀況以及孢子量積累規(guī)律等要有更加清楚的了解，以便指導(dǎo)工業(yè)發(fā)酵和基礎(chǔ)研究。生長(zhǎng)曲線反映了培養(yǎng)過程中生長(zhǎng)和繁殖的規(guī)律，同一種黑曲霉在不同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)曲線也不盡相同，通過生長(zhǎng)曲線了解菌體的生長(zhǎng)繁殖情況，對(duì)于根據(jù)不同的需求有效地利用黑曲霉具有重要的意義。

為更好地開發(fā)這種生防菌劑，為工業(yè)生產(chǎn)提取大量原料，需要大量黑曲霉孢子來支持生產(chǎn)和研發(fā)工作。測(cè)定孢子數(shù)量的方法主要有直接血球板計(jì)數(shù)法和間接平板菌落計(jì)數(shù)法[11]，這些方法均較復(fù)雜，耗時(shí)，精確度低，所以在實(shí)際應(yīng)用中需要尋找更加便捷且精確度高的測(cè)定方法。在釀酒酵母的開發(fā)利用中，苑偉等[13]采用分光光度法，以菌懸液OD值來衡量釀酒酵母對(duì)乙醇的耐受性，ANDREW W等[14]利用OD值作為衡量高產(chǎn)菌株基因與環(huán)境相互作用的指標(biāo)。

以分光光度法測(cè)定細(xì)胞濃度的研究已有報(bào)道[11，17]，但黑曲霉xj作為一種絲狀真菌，分光光度法在該類真菌中的應(yīng)用還少見報(bào)道。通過測(cè)定黑曲霉不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同稀釋條件下OD600nm值，對(duì)比血球板計(jì)數(shù)法測(cè)得的孢子濃度，尋找OD600nm值與孢子濃度之間的關(guān)系，探究用分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子懸液濃度的可行性。此外，采用微電影拍攝法對(duì)黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成過程進(jìn)行研究，在固體發(fā)酵條件下繪制出孢子濃度增長(zhǎng)曲線，驗(yàn)證分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子濃度的實(shí)用性，為測(cè)定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保存（No：M206021）；麥麩：汝州市華豫面業(yè)有限公司；土豆：市售；葡萄糖：成都金山化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：上海微生物科技有限公司；

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，自來水1 L，pH自然。121℃滅菌20 min。

麥麩（wheat bran）培養(yǎng)基：麥麩與自來水按照料液比1∶1（g∶mL）混合，拌勻，pH 7.5。121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV757CRT型紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；CX31型數(shù)碼生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；PHS-3D型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

挑取斜面黑曲霉菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)5 d，備用。

1.3.2 孢子懸液的制備

無菌條件下以0.1%（V/V）吐溫-80溶液沖洗培養(yǎng)基表面，制成孢子懸液并在4℃條件下保存，孢子懸液濃度采用血球板計(jì)數(shù)法得到。

1.3.3 固體發(fā)酵方法

麥麩培養(yǎng)基在121℃滅菌20 min后，無菌條件下接入黑曲霉xj孢子懸液2 mL（1×105～2×105個(gè)/mL），混勻后置于28℃條件下恒溫培養(yǎng)。

1.3.4 分光光度法測(cè)孢子懸液OD值

取制備好的孢子懸液，在波長(zhǎng)λ=600 nm處測(cè)定光密度值（OD600nm），使OD600nm值在0.1～0.8[15-16]，并分別利用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子濃度。

1.3.5 OD600nm值與稀釋倍數(shù)回歸方程的建立

分別取對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的孢子懸液，記錄稀釋倍數(shù)與具體的OD600nm值，以稀釋倍數(shù)為自變量，OD600nm值為因變量建立回歸方程。

1.3.6 OD600nm值與孢子濃度回歸曲線的繪制

分別取對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的孢子懸液，控制OD600nm在 0.1～0.8之間，以O(shè)D600nm為橫坐標(biāo)，孢子濃度為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線。

1.3.7 黑曲霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察

取孢子懸液2mL（1×105～2×105個(gè)/mL）接種于麥麩培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)，分別于2 h、6 h、8 h、22 h、27 h、32 h、35 h、37 h時(shí)用粘片法[11]觀察黑曲霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成動(dòng)態(tài)。

1.3.8 黑曲霉生長(zhǎng)曲線的繪制

取孢子懸液2 mL（1×105～2×105個(gè)/mL）接種于麥麩培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng)，分別于0、40 h、64 h、88 h、112 h、120 h、144 h、168 h、192 h時(shí)隨機(jī)取樣以分光光度法測(cè)孢子濃度，繪制黑曲霉生長(zhǎng)曲線。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均在相同條件下重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）形式表示，所有圖像由Minitab17.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 OD600nm值與稀釋倍數(shù)回歸方程的建立

黑曲霉在不同生長(zhǎng)時(shí)期下，隨機(jī)取一定質(zhì)量樣品制成孢子懸液，利用分光光度法測(cè)定不同稀釋倍數(shù)下λ=600 nm時(shí)的OD值，以O(shè)D600nm表示。用直接血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的孢子懸液濃度，結(jié)果如表1所示。

表1 黑曲霉xj不同生長(zhǎng)期、不同稀釋條件下孢子懸液的OD600nm值和孢子濃度的關(guān)系Table 1 Relationship of OD600nmvalue and spore concentration of A.nigerxj spore suspension under different growth stages and dilution ratios

利用OD600nm值來衡量細(xì)胞濃度時(shí)必須把OD600nm值回歸到統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)上才可以比較[17]。由表1研究發(fā)現(xiàn)，無論處于對(duì)數(shù)期還是穩(wěn)定期，不同的稀釋倍數(shù)范圍下，稀釋倍數(shù)與OD600nm值之間有不同的線性關(guān)系，數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（即標(biāo)準(zhǔn)差）不同。將稀釋倍數(shù)為2～10倍、10～20倍、20～30倍作為三個(gè)區(qū)間，然后在相應(yīng)區(qū)間內(nèi)對(duì)OD600nm值進(jìn)行分段線性回歸，結(jié)果如表2所示。由表2可知，在10～20倍稀釋區(qū)間內(nèi)，對(duì)數(shù)期時(shí)稀釋倍數(shù)與OD600nm值相關(guān)系數(shù)R2=0.984 8，穩(wěn)定期時(shí)二者間相關(guān)系數(shù)R2=0.9913，無論對(duì)數(shù)期還是穩(wěn)定期均表現(xiàn)出較其他稀釋區(qū)間更明顯的線性關(guān)系，且在此稀釋區(qū)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差較小，數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性較高，分段回歸方程可以用于OD600nm回歸值的計(jì)算。

表2 黑曲霉xj孢子懸液不同稀釋區(qū)間OD600nm值分段回歸方程Table 2 Piecewise regression equations of OD600nmofA.nigerxj spore suspension in different dilution range

2.2 不同生長(zhǎng)期孢子濃度與OD600nm值的關(guān)系

在10～20倍稀釋區(qū)間內(nèi)，OD600nm值穩(wěn)定在0.1～0.8之間，數(shù)據(jù)可靠度高；OD600nm值標(biāo)準(zhǔn)差小，數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性好。為了探究OD600nm值與孢子濃度之間的關(guān)系，在10～20倍稀釋區(qū)間內(nèi)，選取了對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的孢子懸液來研究黑曲霉xj不同生長(zhǎng)期OD600nm值與血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所得的孢子濃度之間的關(guān)系，結(jié)果見圖1。

由圖1A可知，在對(duì)數(shù)期OD600nm值與孢子數(shù)量之間存在良好的線性關(guān)系，回歸方程和為y=6.663 71x+0.096 50，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 3，當(dāng)OD600nm為0.618時(shí)，孢子數(shù)量為4.20×106個(gè)/mL。在對(duì)數(shù)期，OD600nm值和孢子濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，說明在這一時(shí)期，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)成熟并穩(wěn)定產(chǎn)生孢子，衰老或死亡很少發(fā)生，可以用OD600nm值較為準(zhǔn)確地反映孢子濃度。

同樣，由圖1B可知，在穩(wěn)定期OD600nm值與孢子濃度之間仍存在良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=6.8755x+0.1372，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 6，當(dāng)OD600nm值為0.618時(shí)，孢子數(shù)量為4.39×109個(gè)/mL。穩(wěn)定期OD600nm值和孢子濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系表明，即使菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，但孢子數(shù)量不受菌體的生長(zhǎng)情況和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的影響，而是保持相對(duì)恒定的數(shù)量水平，所以在穩(wěn)定期仍可以用OD600nm值較為準(zhǔn)確地反映孢子濃度。

圖1 對(duì)數(shù)期（A）及穩(wěn)定期（B）OD600nm值與孢子濃度的關(guān)系Fig.1 Relationship between OD600nmvalue and spore concentration in log phase(A)and stable phase(B)

對(duì)比對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期OD600nm值和孢子濃度之間的回歸方程可知，孢子濃度的大小僅與OD600nm值存在唯一線性關(guān)系，不同的生長(zhǎng)期對(duì)于二者之間的線性關(guān)系沒有影響。當(dāng)OD600nm=0.618時(shí)，二者的孢子濃度分別為4.20×106個(gè)/mL和4.39×106個(gè)/mL，標(biāo)準(zhǔn)差S=1.34×105。在科學(xué)研究中，很多情況下對(duì)于微生物孢子濃度有明確要求，利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度比較繁瑣且主觀因素影響較大，故利用OD600nm與孢子濃度之間的關(guān)系，可以及時(shí)準(zhǔn)確地了解孢子濃度，而且兩者之間的線性關(guān)系不受微生物生長(zhǎng)期的影響，具有很好的普適性。

2.3 黑曲霉產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察和孢子濃度增長(zhǎng)曲線的

繪制

采用微電影拍攝的方法研究黑曲霉xj從孢子萌發(fā)到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)成熟并開始散落孢子的整個(gè)過程，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成分階段進(jìn)行，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成開始于營(yíng)養(yǎng)菌絲充分生長(zhǎng)、形成菌絲網(wǎng)之后。培養(yǎng)2 h時(shí)，孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，開始營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；培養(yǎng)6 h時(shí)，隨著營(yíng)養(yǎng)菌絲不斷進(jìn)行頂端生長(zhǎng)，菌絲直徑增加，菌絲開始分支；培養(yǎng)22 h時(shí)，菌絲不斷分支，分支的菌絲交織形成復(fù)雜的菌絲網(wǎng)，在菌絲網(wǎng)上開始分化產(chǎn)生生殖菌絲，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)初見雛形，頂囊已經(jīng)形成；培養(yǎng)27 h時(shí)，在成熟的頂囊上開始產(chǎn)生一輪小梗；培養(yǎng)32 h時(shí)，一輪小梗生長(zhǎng)成熟，開始產(chǎn)生二輪小梗；培養(yǎng)35 h時(shí)，二輪小梗生長(zhǎng)完成，至此產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)完全形成，開始產(chǎn)生孢子；培養(yǎng)37 h時(shí)，孢子成熟，從二輪小梗上散落下來，孢子數(shù)量開始增加。

圖2 黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)Fig.2 Conidial fructification ofA.nigerxj

在麥麩培養(yǎng)基中隨機(jī)取一定質(zhì)量樣品制成孢子懸液，用分光光度法測(cè)得孢子懸液濃度，繪制黑曲霉xj生長(zhǎng)曲線見圖3。

圖3 黑曲霉xj生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve ofA.nigerxj

由圖3可知，孢子濃度的增長(zhǎng)呈S形曲線。發(fā)酵時(shí)間0～40 h為生長(zhǎng)遲緩期，該時(shí)期孢子數(shù)量基本不增加，主要是營(yíng)養(yǎng)菌絲的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形成，此時(shí)還沒有成熟的孢子從產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)上散落，與圖2觀察到的結(jié)果相符；發(fā)酵時(shí)間50～100h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，該時(shí)期孢子數(shù)量急劇上升，主要由于產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)育成熟，大量的孢子從產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)上散落，營(yíng)養(yǎng)環(huán)境優(yōu)越，有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供其持續(xù)、大量地產(chǎn)孢；發(fā)酵時(shí)間100～168 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期，該時(shí)期孢子數(shù)量維持在一個(gè)相對(duì)恒定的水平不再增加，推測(cè)主要是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的制約，發(fā)酵過程中各種有害物質(zhì)的積累以及菌絲的衰老、死亡，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的退化無法繼續(xù)產(chǎn)孢；發(fā)酵時(shí)間168～192 h出現(xiàn)衰亡的趨勢(shì)，孢子濃度未出現(xiàn)明顯的下降（P＞0.05），主要由于發(fā)酵時(shí)間較短，還未檢測(cè)到明顯的衰亡期。

3 結(jié)論

本研究采用分光光度法測(cè)定黑曲霉xj在不同生長(zhǎng)期、不同稀釋條件下的OD600nm值，研究不同生長(zhǎng)期OD600nm值與稀釋倍數(shù)、OD600nm值與孢子濃度之間的關(guān)系。結(jié)果表明，無論對(duì)數(shù)期還是穩(wěn)定期，在10～20倍稀釋區(qū)間內(nèi)，OD600nm值與稀釋倍數(shù)之間保持良好的線性關(guān)系，在此稀釋區(qū)間內(nèi)，OD600nm值介于0.1～0.8之間，可以很好地滿足分光光度計(jì)的測(cè)定要求，數(shù)據(jù)可信度高，OD600nm值標(biāo)準(zhǔn)差小，數(shù)據(jù)波動(dòng)小，可重復(fù)性好；同時(shí)，OD600nm值與孢子濃度之間也保持有良好的線性關(guān)系。

此外，通過微電影拍攝法記錄黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成的動(dòng)態(tài)過程，對(duì)于黑曲霉xj產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形成過程中的動(dòng)態(tài)變化有了較為清楚地認(rèn)識(shí)。繪制固體發(fā)酵過程中孢子濃度增長(zhǎng)曲線，驗(yàn)證了分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子濃度的實(shí)用性。本研究用OD值來反映培養(yǎng)體系中孢子濃度，為絲狀真菌的生產(chǎn)以及基礎(chǔ)研究中有關(guān)孢子濃度的測(cè)定提供了理論指導(dǎo)，為測(cè)定絲狀真菌孢子濃度提供另一種可借鑒的方法。

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Determination ofAspergillus nigerspores concentration by spectrophotometry

YUAN Hongwei1,CHEN Hufang1,GAO Dongmin1,LIU Xuece1,GUO Bokai2,LI Zhu1*
(1.College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Provincial People's Hospital,Guiyang 550025,China)

OD600nmvalues ofAspergillus nigerxj spore suspension was determined by spectrophotometer under different growth stages and dilution ratios,comparing to the spore suspension concentration which was determined by the blood bat counting method,the relationship between OD600nmvalue and spore concentration in log phase and stable phase were investigated.The micro film shooting method was used to observe the forming process ofA.nigerxj conidial fructification and the growth curve of spore under a solid-state fermentation condition was drawn.The results showed that in the 10-20 times dilution range,it showed a good linear relationship between dilution ratio and OD600nmvalue(log phaseR2=0.984 8,stable phaseR2=0.991 3),and there also had a good linear relationship between OD600nmvalue and spore concentration(log phaseR2=0.995 3,stable phase R2=0.993 6).Moreover,it could be observed that the formation ofA.nigerxj conidial fructification was a stage process through the micro film shooting method,and spore concentration showed a"S"type growth trend during a solid-state fermentation.The study provided another referential method for the determination of filamentous fungal spore concentration.

spectrophotometry;Aspergillus niger;spore concentration;conidial fructification;growth curve

Q939.96

0254-5071（2017）04-0122-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.026

2016-10-24

貴州省社發(fā)公關(guān)[SY（2014）3053];國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460486）；貴州省農(nóng)業(yè)公關(guān)[NY（2014）3033]；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目[2015（006）]；畢節(jié)煙草公司自然科學(xué)基金項(xiàng)目[2011（06）]

袁洪威（1996-），男，本科生，研究方向?yàn)槲⑸镛r(nóng)藥。

*通訊作者：李祝（1978-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镛r(nóng)藥。