耐受乙醇巴氏醋桿菌ZJ-25培養基的優化

胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北武漢430068）

耐受乙醇巴氏醋桿菌ZJ-25培養基的優化

胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業大學工業發酵湖北省協同創新中心湖北省食品發酵工程技術研究中心，湖北武漢430068）

以中國傳統固態發酵醋醅中分離得到的1株耐受12%vol乙醇的巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）ZJ-25為出發菌株，以產酸量為評價指標，采用單因素試驗和正交試驗設計對培養基配方進行了優化。結果表明，最佳培養基組合為葡萄糖3%、酵母粉3%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在此最佳培養基條件下，菌株ZJ-25的產酸量由常規培養基條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。

醋酸菌；耐乙醇；培養基；優化

醋酸菌是釀醋工業的核心菌種。在釀醋工業中，最常用于釀醋的醋酸菌是醋桿菌屬（Acetobacter），其中菌株的優劣直接影響成醋的產量、質量及風味[1-3]。巴氏醋酸菌能夠更為高效轉化酒精生成醋酸，同時其含有豐富的氧化酶系，不僅能夠將酒精轉化為醋酸，還能氧化形成琥珀酸、檸檬酸等有機酸，對醋的風味形成有較大影響[4-5]。醋酸菌在食品、化工、醫藥等行業有著較為廣泛的應用，在葡萄糖酸和二羥基丙酮的微生物合成中有著重要的作用，該類菌株還具有固氮作用，能用于細菌纖維素的生產[6-8]。

醋酸菌是一類好氧的產酸細菌，乙醇是醋酸發酵的底物，并且為醋酸菌生長代謝提供能量，溫度和pH是影響醋酸菌生長和代謝的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的重要條件[9-10]。大多數醋酸菌株可用六碳糖作為碳源，并且在發酵過程中產生大量的代謝產物CO2、醋酸、乳酸、丙酸以及丙酮等。關于培養基的相關研究已經表明，醋酸桿菌發酵的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉[11-13]，此外，外源乙醇和乙酸也是發酵培養基中常添加的成分[14-15]。

本研究以中國傳統固態發酵醋醅中分離得到的1株巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25為出發菌株，碳源選用葡萄糖，氮源選用酵母粉，同時添加不同濃度的乙醇和乙酸，對培養基配方進行正交試驗優化，這將為菌種的進一步研究提供理論依據，為菌種的工業應用打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25：由本實驗室分離自中國傳統固態發酵的醋醅，可耐受體積分數12%的乙醇溶液。

1.1.2 試劑

無水乙醇、氯化鈉、葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉：上海化學試劑有限公司；碳酸鈣：德興市明緣化工材料有限公司；酚酞：天津市北辰方正試劑廠；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；瓊脂：華順生物技術有限公司；鹽酸：西隴化工股份有限公司。所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

AR323C電子天平：奧豪斯儀器公司；DZ-101C磁力加熱攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；FE20數顯式酸度計、DZF-6050電熱恒溫培養箱、HH4-電熱恒溫水浴鍋、DHG-9070A恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；DXO 7771大龍移液槍：大龍新創實驗儀器有限公司；I8雙光束紫外可見分光光度計：濟南海能儀器有限公司；HNY-2112B柜式全溫震蕩培養箱：天津歐諾儀器儀表公司；FY50高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；TGL-20臺式高速離心機：武漢中科科儀技術發展有限責任公司；SW-CJ凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高耐受性醋酸桿菌培養基單因素試驗

（1）葡萄糖添加量對菌株產酸量的影響：取500mL三角瓶，設置5個處理，葡萄糖添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為酵母粉3%、乙醇6%、乙酸0.1%，用少量水溶解，并加水定容至150 mL，移至三角瓶中，121℃滅菌15 min；在以下條件下進行揺瓶發酵，將4%醋酸菌液體菌種接種已滅菌的三角瓶發酵培養基中，在溫度38℃、pH 5.0、搖床轉速160 r/min，發酵時間6 d[16]的條件下每個處理組重復3次，發酵結束后測定發酵液中的產酸量。

（2）酵母粉添加量對菌株產酸量的影響：取500 mL三角瓶，設置5個處理，酵母粉添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為葡萄糖3.0%、乙醇6.0%、乙酸0.1%，加水配制成150 mL的培養基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發酵。

（3）乙醇添加量對產酸量的影響：取500 mL三角瓶，設置5個處理，乙醇添加量分別為4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%，其他成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙酸0.1%，配制成150 mL的培養基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發酵。

（4）乙酸添加量對產酸量的影響：取500 mL三角瓶，設置5個處理，乙酸添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，其他成分為葡萄糖添加量3.0%、酵母粉添加量3.0%、乙酸添加量0.1%，配制成150 mL的培養基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進行揺瓶發酵。

1.3.2 高耐乙醇醋酸桿菌培養基配方正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取葡萄糖、酵母粉、乙醇和乙酸的添加量等4個因素，采用4因素3水平的正交試驗對巴氏醋桿菌ZJ-25的發酵培養基配方進行優化，正交試驗因素與水平見表1。以發酵結束后的產酸量為評價指標，確定最優培養基配方。

表1 培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 菌株產酸量的測定

精密量取3.0 mL樣品于250 mL錐形瓶中，加50 mL水，滴加1～2滴酚酞試劑，放入磁力攪拌子并置于磁力攪拌器上攪拌，邊攪拌邊滴入氫氧化鈉標準溶液進行滴定。當溶液由無色變為粉色時停止滴加，讀取氫氧化鈉標準滴定溶液消耗的體積。具體測定方法參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[17]。

2 結果與分析

2.1 高耐受性醋酸桿菌培養基單因素試驗

2.1.1 葡萄糖添加量對菌株產酸量的影響

葡萄糖添加量對菌株產酸量的影響見圖1。由圖1可知，當葡萄糖添加量為2.0%～3.0%時，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產酸量逐步升高，其中葡萄糖添加量為3.0%時，產酸量最高，為36.9 g/L；葡萄糖添加量＞3.0%時，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產酸量呈明顯下降趨勢；當葡萄糖添加量過少時，碳源不足，醋酸菌的數量少，產酸量偏低，當葡萄糖的添加量過多時，消耗了大量的營養物質，導致產酸量過低。因此，葡萄糖的最宜添加量為3.0%。

圖1 葡萄糖添加量對菌株產酸量的影響Fig.1 Effect of glucose addition on acid yield of strains

2.1.2 酵母粉添加量對菌株產酸量的影響

圖2 酵母粉添加量對菌株產酸量的影響Fig.2 Effect of yeast powder addition on acid yield of strains

酵母粉添加量對菌株產酸量的影響見圖2。由圖2可知，當酵母粉添加量為2.0%～3.0%時，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產酸量逐步升高，其中酵母粉添加量為3.0%時，產酸量最高，為37.3 g/L；酵母粉添加量＞3.0%時，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產酸量呈明顯下降趨勢。當酵母粉添加量過少時，氮源不足，醋酸菌的數量少，產酸量偏低，當酵母粉的添加量過多時，消耗了大量的營養物質，導致產酸量過低。因此，酵母粉的最宜添加量為3.0%。

2.1.3 乙醇添加量對菌株產酸量的影響

乙醇添加量對菌株產酸量的影響見圖3。由圖3可知，當乙醇添加量為4.5%～5.5%時，隨著乙醇添加量的增加，菌株產酸量逐步升高，其中乙醇添加量為5.5%時，產酸量最高，為42.5 g/L；乙醇添加量＞5.5%時，隨著乙醇添加量的增加，菌株產酸量呈明顯下降趨勢。乙醇會氧化為乙酸，當乙醇添加量過少時，乙酸產量偏低；乙醇添加量過大時，會抑制醋酸菌產乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性，導致乙酸產量的減少。因此，乙醇的最宜添加量為5.5%。

圖3 乙醇添加量對菌株產酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol addition on acid yield of strain

2.1.4 乙酸添加量對菌株產酸量的影響

圖4 乙酸添加量對菌株產酸量的影響Fig.4 Effect of acetic acid addition on acid yield of strain

乙酸添加量對菌株產酸量的影響見圖4。由圖4可知，當乙酸添加量為0.05%～0.10%時，隨著乙酸添加量的增加，菌株產酸量逐步升高，其中乙酸添加量為0.10%時，產酸量最高，為42.9 g/L；乙酸添加量＞0.10%時，隨著乙酸添加量的增加，菌株產酸量呈明顯下降趨勢。乙酸會刺激醋酸菌產乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，添加適宜量的乙酸會增加菌株的產酸量。因此，乙酸的最宜添加量為0.10%。

2.2 高耐受性醋酸桿菌培養基正交試驗結果

醋酸菌培養基配方優化正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知，從正交試驗各項因素的極差和離差平方和可以看出各因素對醋酸積累的影響強度依次為葡萄糖＞酵母粉＞乙醇＞乙酸。根據直觀分析可得到的優化的菌發酵培養基組合為A2B2C3D1，此時產酸量為43.8g/L。通過極差分析得到最佳的試驗組合為A2B2C2D3，將得到培養基優化結果進行驗證試驗，產酸量為44.5 g/L，通過產酸量的比較，得到最佳的試驗組合是A2B2C2D3，即培養基組分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%，將得到的培養基優化結果進行3次驗證試驗，平均產酸量為44.3g/L。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

表3的方差分析表明，葡萄糖和酵母粉添加量對菌株產酸量的影響極顯著（P＜0.01），乙醇添加量對產酸量影響顯著（P＜0.05），添加乙酸添加量對產酸量的影響不顯著。

3 結論

本研究對中國傳統固態發酵醋醅中分離得到的1株高耐受性巴氏醋桿菌ZJ-25的培養基進行了優化。通過對培養基中的葡萄糖、酵母粉、乙醇、乙酸的添加量采取正交試驗優化，得出該菌的最優培養基成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在發酵溫度32℃、轉速180r/min、發酵天數6d、初始pH6.0的發酵條件下，巴氏醋桿菌ZJ-25的產酸量由常規條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。為巴氏醋桿菌ZJ-25的進一步研究及工業應用提供理論依據。參考文獻：

[1]程麗娟，袁靜.發酵食品工藝學[M].楊凌：西北農林科技大學出版社，2002：273-275.

[2]李大為，朱運平，李秀婷，等.懷山藥醋的發酵工藝研究[J].中國食品添加劑，2016（10）：45-49.

[3]張臘酶，王樹林.醋酸菌液態發酵產酸的研究[J].青海大學學報：自然科學版，1999，17（5）：26-28.

[4]周秉辰.論高酸度食醋的生產[J].中國釀造，1991，10（4）：26-29.

[5]宋勇強，贠建民，安志剛，等.基于正交設計與人工神經網絡模型的醋酸菌A3菌株醋酸發酵條件優化[J].食品工業科技，2013，34（5）：142-146.

[6]武斌，李麗，趙良啟.醋酸菌培養條件的優化及醋酸分批發酵[J].食品與藥品，2007，9（1）：11-14.

[7]劉曉棟，佘躍惠，張鴻翼.醋酸菌培養條件研究[J].化學工程師，2007（1）：17-19.

[8]何志剛，李維新，林曉姿，等.枇杷酒醋化過程醋酸菌的生長，產酸及耗氧的關系[J].食品與發酵工業，2008，34（12）：22-25.

[9]蘇迎會.固態發酵食醋生產過程中主要微生物及風味生成的探討[J].中國釀造，2015，34（3）：137-140.

[10]郭養浩，康小紅，李斌，等.醋酸發酵過程中的底物抑制和產物抑制效應[J].中國釀造，1992，11（3）：22-25.

[11]SAEKI A,THEERAGOOL G,MATSUSHITA K,et al.Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at higher temperatures[J].Biosci Biotech Biochem,1997,61(1):138-145.

[12]陳浙江.高活性醋酸桿菌的選育和乙醇脫氫酶提取[D].上海：上海師范大學，2008.

[13]邵金華，陳小明，李玲，等.葛根醋發酵的液化及糖化工藝研究[J].中國食品添加劑，2016（12）：66-72.

[14]王瑩，欒天奇，樸美子.基于神經網絡和遺傳算法的醋酸發酵培養基優化[J].中國食品學報，2012，12（5）：88-94.

[15]趙爽.四川麩醋中優良醋酸菌的篩選及其在液態發酵麩醋中的應用[D].雅安：四川農業大學，2014.

[16]陳洋.耐乙醇醋酸菌特性研究及應用[D].武漢：湖北工業大學，2016.

[17]中國食品發酵工業研究院.GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[S].北京：中國標準出版社，2008.

Optimization of culture medium for ethanol-tolerantAcetobacter pasteurianusZJ-25

HU Yuhao,LI Daiyang,WANG Chao,GAO Bing,LI Dongsheng,XU Ning,HU Yong*
(Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

UsingAcetobacter pasteurianusisolated from vinegar grains of traditional Chinese solid-state fermentation with 12%vol ethanol tolerance as original strain,using acid yield as evaluation index,the medium formula forA.pasteurianusZJ-25 culture for acid production was optimized by single factor and orthogonal experiments.Results showed that the optimal medium formula was as follows:glucose 3%,yeast powder 3%,ethanol 5.5%,acetic acid 0.12%.Under these conditions,the acid yield of strain ZJ-25 increased from 32.5 g/L to 44.3 g/L.

acetic acid bacteria;ethanol tolerant;culture medium;optimization

TS264.2

0254-5071（2017）04-0118-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.025

2016-11-10

湖北省自然科學基金（2015CFB678）；湖北省級教育部門青年人才項目（Q20151412）

胡宇豪（1993-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物和發酵工程。

*通訊作者：胡勇（1980-），男，講師，博士，研究方向為細胞工程。