響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件

許曌昕，曾輝，曾德勇，3，曹文濤*，王芙蓉，席德州

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州盛世甲秀酒業(yè)有限公司，貴州貴陽550004；3.貴州茅臺（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州黔東南557500）

響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件

許曌昕1，曾輝2，曾德勇1，3，曹文濤1*，王芙蓉1，席德州1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州盛世甲秀酒業(yè)有限公司，貴州貴陽550004；3.貴州茅臺（集團(tuán)）生態(tài)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州黔東南557500）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到提高菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的目的。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為葡萄糖用量50 g/L、豆粕粉40 g/L、CaCl2添加量0.44 g/L；最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度40℃、初始pH 7.0、接種量6.0%、發(fā)酵時間40 h，在此條件下，該菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)到192.7 U/mL。

解淀粉芽孢桿菌；中性蛋白酶；響應(yīng)面法；條件優(yōu)化

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，也是重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于洗滌劑、皮革、毛皮、釀酒、醬油以及紡織、醫(yī)藥品、化妝品等的生產(chǎn)和生物材料的提取[1-2]。應(yīng)用最多的微生物蛋白酶主要由芽孢桿菌屬和曲霉菌屬產(chǎn)生，細(xì)菌的中、堿性蛋白酶通常是用液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)，而霉菌蛋白酶則更適于采用固體培養(yǎng)法生產(chǎn)，固體培養(yǎng)不易污染、容易管理、節(jié)省能源、單位容器產(chǎn)量高。國內(nèi)外對真菌、芽孢桿菌生產(chǎn)蛋白酶做了大量的研究，對產(chǎn)酶培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件都有較多的探討[3-7]，然而，利用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）生產(chǎn)中性蛋白酶的研究則很少[8-9]。

解淀粉芽孢桿菌是一種好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，具有廣譜抗菌活性和較強(qiáng)的抗逆能力，在自然界分布廣泛，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，且其代謝產(chǎn)物較為豐富[10]。傳統(tǒng)發(fā)酵制品及其環(huán)境中有著豐富的微生物資源，這些微生物在長期的生產(chǎn)過程中緩慢馴化，使其表現(xiàn)出各種穩(wěn)定的優(yōu)良特性[11]。本試驗(yàn)以從茅臺高溫大曲中篩選出的高產(chǎn)中性蛋白酶解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）GZUB-7作為研究對象，該菌生長迅速，在脫脂牛奶平板上水解圈與菌落直徑比高達(dá)6.64，產(chǎn)中性蛋白酶活力明顯高于其他細(xì)菌，參考芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶優(yōu)化方法[12-13]，采用響應(yīng)面法對該菌產(chǎn)酶的發(fā)酵液組成成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為擴(kuò)大微生物菌種資源的開發(fā)和提高解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）GZUB-7：從茅臺高溫大曲中篩選出的一株高產(chǎn)中性蛋白酶的菌株。由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0～7.2，分裝錐形瓶，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：葡萄糖60 g/L，豆粕粉60 g/L，CaCl20.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，pH 8.0，121℃滅菌20 min。

1.1.2 試劑

CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4、Na2HPO4·12H2O、硫酸銨（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HCl（分析純）：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、瓊脂粉（生化試劑）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技公司；豆粕粉及麩皮：貴陽市油榨街農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204TE電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；THZ-98C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；pHS-3G型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-16G型臺式高速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；LDZX-40B型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；722N型分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；QYC-2112/ KYC-1112恒溫培養(yǎng)搖床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)條件及發(fā)酵

將解淀粉芽孢桿菌GZUB-7從斜面轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨平板上活化，35℃恒溫培養(yǎng)24h。取裝液量為50mL/250mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種活化的菌種，于35℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后作為種子液。將種子液轉(zhuǎn)接到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3.2 中性蛋白酶活力的測定

將10 mL發(fā)酵液在4℃條件下4 000 r/min離心15 min，取上清液5 mL，以磷酸緩沖液（pH7.2）稀釋至25 mL，用福林酚法測定發(fā)酵液中的中性蛋白酶酶活力[14]。酶活力單位定義：在pH 7.2、40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活性單位（U/mL）。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，分別考察培養(yǎng)基不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉）、氮源（麩皮、蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨）、無機(jī)鹽（CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4）、初始pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、發(fā)酵溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）、發(fā)酵時間（0、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h）對中性蛋白酶酶活力的影響，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計法[15]，以碳氮比（C/N）、CaCl2用量和接種量為自變量，以中性蛋白酶的酶活為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。采用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源、氮源對解淀粉芽孢桿菌GZUB-7發(fā)酵產(chǎn)酶

活力的影響

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，以麩皮、蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨作為培養(yǎng)基的氮源，考察不同碳源、氮源對中性蛋白酶酶活力的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源、氮源對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.1 Effect of different carbon sources and nitrogen sources on neutral protease activity

由圖1可知，以葡萄糖作為碳源時，解淀粉芽孢桿菌GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶酶活力最高，為95.6 U/mL，而以麥芽糖作為碳源次之，二者明顯高于蔗糖、淀粉作為碳源時的酶活力，因而選擇可以直接利用的葡萄糖作為碳源；微生物能夠利用的氮源分有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種，選用蛋白胨作為氮源時酶活最高，豆粕粉稍次之，而用無機(jī)氮源硫酸銨時酶活很低，說明硫酸銨不利于該菌株產(chǎn)酶，考慮成本原因，選用來源廣、成本低的豆粕粉作為氮源。

2.1.2 葡萄糖和豆粕粉用量對中性蛋白酶酶活力的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖作為碳源，豆粕粉作為氮源，用量分別為20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70g/L，對中性蛋白酶活力的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2（A）可知，當(dāng)葡萄糖用量為20～50 g/L時，中性蛋白酶活力逐漸上升；當(dāng)葡萄糖用量為50 g/L時，產(chǎn)生的酶活力最高為111.4 U/mL；之后隨著葡萄糖用量的增多，酶活力有所下降，故確定葡萄糖用量為50 g/L。

氮源在代謝過程中被降解為氨基酸等含氮化合物，除供自身生長需要外，還參與酶的合成，因此氮源用量對于產(chǎn)酶有重要作用。由圖2（B）可知，當(dāng)豆粕粉用量為20～40 g/L時，中性蛋白酶活力呈上升趨勢；當(dāng)豆粕粉用量增加至70 g/L時，蛋白酶活力反而下降，說明過量的氮源并不能增加酶的產(chǎn)量，反而會抑制酶的活力，因此選擇豆粕粉用量為40 g/L。

圖2 葡萄糖(A)和豆粕粉(B)的用量對酶活力的影響Fig.2 Effect of glucose(A)and soybean cake powder(B) addition on neutral protease activity

微生物的生長和代謝離不開碳和氮這兩種重要的營養(yǎng)元素，兩者在量上的比例關(guān)系為碳氮比（C/N）。C/N作為影響因子，參與細(xì)菌的產(chǎn)能代謝過程，主要作用于微生物的自身合成代謝過程和有機(jī)物在微生物體內(nèi)的生物氧化過程。因此，對菌株生長與產(chǎn)物的代謝的影響來講，C/N的影響更加重要。在單因素試驗(yàn)中，最終確定的最佳碳源為葡萄糖，用量為50 g/L，最佳氮源為豆粕粉用量為40 g/L，理論碳氮比為1.25。為了研究最佳的影響因素，選擇C/N為1.00、1.25、1.50進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 不同無機(jī)鹽及用量對中性蛋白酶酶活力的影響

分別添加CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4作為無機(jī)鹽，用量為0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L，測定發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，CaCl2對解淀粉芽孢桿菌GZUB-7發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶活力有顯著影響，當(dāng)CaCl2用量為0.4 g/L時，中性蛋白酶活達(dá)到最大147.1 U/mL。隨著MgCl2用量的增加，中性蛋白酶活力呈下降趨勢，微量的Mg2+會抑制蛋白酶的產(chǎn)量；隨NaCl用量的增加，菌株GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶活力先增加后減小，但是始終低于CaCl2為無機(jī)鹽時中性蛋白酶活力；而FeSO4對菌株GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶活力影響較小，且中性蛋白酶活力較低。因此選擇用量0.4 g/L CaCl2為發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽。

圖3 不同金屬鹽對酶活的影響Fig.3 Effect of different metal salts on neutral protease activity

2.1.4 初始pH值對中性蛋白酶酶活力的影響

考察發(fā)酵液初始pH值對發(fā)酵液中性蛋白酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨初始pH值的增加，中性蛋白酶活力呈先增加后降低的趨勢，中性條件下有利于其產(chǎn)酶，當(dāng)初始pH值為7.0時，菌株GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶活力最大，為166.3 U/mL；發(fā)酵液初始pH值為7.0時產(chǎn)酶效果相對較佳，但差異不是特別明顯，因此，選擇發(fā)酵液初始pH 7.0為宜。

圖4 初始pH值對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.4 Effect of initial pH on neutral protease activity

2.1.5 接種量對中性蛋白酶酶活力的影響

考察不同的接種量對中性蛋白酶酶活力的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)接種量為6%時，中性蛋白酶酶活力高達(dá)186.3 U/mL，相比3%時的酶活增加80%，但接種量為7%時，酶活力反而下降。這可能與底物競爭相關(guān)，因此，選擇接種量6%為宜。

圖5 接種量對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on neutral protease activity

2.1.6 發(fā)酵溫度對中性蛋白酶酶活力的影響

該解淀粉芽孢桿菌GZUB-7從茅臺高溫大曲中篩選得到，能夠耐受較高的溫度。由圖6可知，發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶酶活影響不大，在40℃時所產(chǎn)酶活較高，因此選擇40℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。

圖6 發(fā)酵溫度對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on neutral protease activity

2.1.7 發(fā)酵時間對中性蛋白酶活力的影響

圖7 不同發(fā)酵時間下菌體生長與蛋白酶活力的關(guān)系Fig.7 Relationship between cell growth and protease activity in different fermentation time

由圖7可知，該菌株接入種子液后16 h就可以進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期可以持續(xù)8 h以上。觀察酶活力曲線，對數(shù)生長期就有蛋白酶產(chǎn)生，表明中性蛋白酶與細(xì)胞生長在對數(shù)生長期同步進(jìn)行，而進(jìn)入生長穩(wěn)定期后開始大量分泌蛋白酶，40 h酶活達(dá)到最大值178.6 U/mL，隨著菌體的溶解，酶活力下降，可能是由于次級代謝產(chǎn)物的積累，使得蛋白酶活力得到抑制。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以C/N、CaCl2添加量和接種量3個因素為變量，中性蛋白酶酶活力為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 構(gòu)建數(shù)學(xué)模型及模型檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。通過對該模型進(jìn)行方差分析，最終得到二次回歸方程為：

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，可得回歸模型方差分析見表3，由表3可知，擬合方程失擬項(xiàng)的值為27.09，P＞F值為0.035 8＜0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)顯著，表明該方程的擬合效果較差。在原有的基礎(chǔ)上，嘗試逐一去掉一個交互項(xiàng)，以減小失擬項(xiàng)LackofFit值，提高方程的擬合效果。初步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)只去掉X1X2交互項(xiàng)時，方程失擬項(xiàng)值變?yōu)?0.71，P＞F值為0.046 6，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)顯著，表明當(dāng)前方程的擬合效果還是較差；由表3可知，去掉X1X2、X2X3交互項(xiàng)后，模型P＜0.000 1，回歸模型顯著，失擬項(xiàng)值變?yōu)?7.01，且失擬項(xiàng)P= 0.056 4＞0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，表明當(dāng)前方程的擬合效果合格，說明去掉X1X2、X2X3項(xiàng)獲得的新方程能獲得更好的擬合效果，即C/N與CaCl2添加量、CaCl2添加量與接種量的交互作用不顯著，接種量與C/N交互作用對中性蛋白酶酶活力的影響顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化最佳組合條件

由方差分析可知，得到C/N與CaCl2添加量、CaCl2添加量與接種量的交互作用不顯著，因此只分析接種量與C/N交互作用對中性蛋白酶酶活力的影響，等高線和響應(yīng)面圖見圖8。由圖8可知，等高線中的最小橢圓的中心點(diǎn)即是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，當(dāng)CaCl2添加量為0.44 g/L時，C/N與接種量交互作用存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn)。

圖8 接種量與C/N交互作用對中性蛋白酶酶活力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum and C/N on neutral protease activity

利用該模型預(yù)測的最佳試驗(yàn)條件為：C/N為1.24，參考單因素中葡萄糖和豆粕粉的試驗(yàn)結(jié)果，得到葡萄糖用量為50 g/L，豆粕粉用量為40.32 g/L，或葡萄糖用量為49.6 g/L，豆粕粉用量為40.32g/L的兩種情況，由于這兩組數(shù)值與單因素試驗(yàn)中所獲得數(shù)據(jù)相差不大，為了方便實(shí)際應(yīng)用，將C/N調(diào)整為1.25，即葡萄糖用量為50g/L、豆粕粉40g/L、CaCl2添加量為0.44 g/L，接種量為6.17%，可以得到最大酶活為193.436 U/mL。

2.2.4 驗(yàn)證最佳條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化最佳組合條件，結(jié)合實(shí)際操作情況，將最佳條件修訂為：C/N為1.25，即葡萄糖用量為50 g/L，豆粕粉40 g/L，CaCl2添加量為0.44 g/L，接種量6.0%，初始pH值為7.0，40℃發(fā)酵40 h，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，中性蛋白酶平均酶活為192.7 U/mL，與預(yù)測值193.436 U/mL非常接近。因而，這個模型是相當(dāng)準(zhǔn)確的，也表明響應(yīng)面法適用于解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZUB-7產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，產(chǎn)中性蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖用量為50g/L、豆粕粉用量為40g/L、CaCl2添加量為0.44g/L，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度40℃、初始pH 7.0、接種量為6.0%、發(fā)酵時間40 h，在此條件下，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，所得中性蛋白酶酶活力平均值為192.7 U/mL，與預(yù)測值（193.44 U/mL）相接近。為進(jìn)一步探索解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶機(jī)理及所產(chǎn)中性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions of neutral protease-producingBacillus amyloliquefaciens by response surface methodology

XU Zhaoxin1,ZENG Hui2,ZENG Deyong1,3,CAO Wentao1*,WANG Furong1,XI Dezhou1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Chengshijiaxiu Wine Co.,Ltd., Guiyang 550004,China;3.Kweichow Moutai(Group)Ecological Agriculture Development Co.,Ltd.,Qiandongnan 557500,China)

In order to improve the neutral protease activity,on the basis of single factor experiments,the fermentation conditions of neutral protease-producingBacillus amyloliquefaciensGZUB-7 were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum components of fermentation medium were glucose 50 g/L,soybean cake powder 40 g/L and CaCl20.44 g/L;the optimum fermentation conditions were fermentation temperature 40℃,initial pH 7.0,inoculum 6.0%and fermentation time 40 h.Under the conditions,the neutral protease activity was up to 192.7 U/ml.

Bacillus amyloliquefaciens;neutral protease;response surface methodology;conditions optimization

TS261.1

0254-5071（2017）04-0078-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.017

2016-04-27

貴州省科技廳工業(yè)公關(guān)項(xiàng)目（20113015）

許曌昕（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c發(fā)酵技術(shù)。

*通訊作者：曹文濤（1967-），男，教授，本科，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。