一株乳酸乳球菌產γ-氨基丁酸能力及其安全性評價

孟丹，王麗群，謝國梁，劉曉艷，于純淼，國立東*

（1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱150086）

一株乳酸乳球菌產γ-氨基丁酸能力及其安全性評價

孟丹1，王麗群2，謝國梁1，劉曉艷1，于純淼1，國立東1*

（1.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱150086）

探討了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201產γ-氨基丁酸的能力，并初步評價了其安全性。以γ-氨基丁酸含量為評價指標，通過正交試驗優化了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株產γ-氨基丁酸的發酵條件，即接種量為4%、初始pH值6.5，發酵溫度31℃，發酵時間60 h，其發酵液中γ-氨基丁酸的質量濃度可達218.7 μg/mL。通過硝基還原酶活性檢測、生物胺產生能力分析、吲哚試驗和溶血性試驗，初步評價了菌株HUCM 201的安全性，發現其硝基還原酶陰性，吲哚試驗陰性，無溶血，不能產生酪胺、組胺、尸胺和腐胺生物胺類物質，可初步認為是一株安全的益生菌。

乳酸菌；γ-氨基丁酸；生物胺；安全性

乳酸菌是一類能利用可發酵糖產生大量乳酸的細菌的通稱[1]，其作為工業微生物應用具有悠久的歷史，廣泛用于酸奶、開菲爾、泡菜等傳統發酵食品的生產。繼“酸奶長壽說”提出之后，乳酸菌對人體健康的有益作用一直是人們關注的焦點，目前公認的益生功能主要包括：調節腸道菌群平衡[2]、調節免疫[3]、降膽固醇[4]、降血壓[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7-8]、抗過敏[9]等。然而，這些益生功能并不是所有乳酸菌的共性，不同種屬的乳酸菌甚至是同一種屬的不同株之間益生功能也不盡相同，但也有集兩種以上益生功能于一身的乳酸菌菌株，如鼠李糖乳桿菌GG株（LGG）[10-11]。課題組先前從傳統發酵乳制品—開菲爾發酵乳中分離到一株乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，益生特性良好[12]且體內外試驗均證實了其降膽固醇作用[13-14]。菌株HUCM 201是否還具有其他益生功能仍不清楚，另外，盡管乳酸菌通常被認為是安全的，但仍有個別關于乳酸菌引起感染事件的報道[15-17]。鑒于此，本試驗對乳酸乳球菌乳亞種菌株HUCM 201產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的能力進行了檢測，并對其安全性進行了初步評價，包括硝基還原酶活性、生物胺產生能力、吲哚生成以及溶血性試驗，旨在為其作為益生菌應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）HUCM 201菌株：來源于開菲爾發酵乳，實驗室自行分離鑒定并保存。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923為黑龍江中醫藥大學實驗室保存。

1.1.2 培養基

改良MRS（mMRS）培養基，參照文獻[18]的方法配制：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，葡萄糖20.0g，吐溫-801.0g，乙酸鈉5.0g，七水硫酸鎂0.58g，四水硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，蒸餾水加至1 L，用HCl調至pH 6.2，121℃濕熱滅菌15 min。

LB培養（基用于培養大腸桿菌）：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水加至1 L，調pH值至7.4，121℃濕熱滅菌15 min。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptonesoybroth，TSB）培養基（用于培養金黃色葡萄球菌）：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，蒸餾水加至1 L，調pH值至pH 7.2±0.2，121℃濕熱滅菌15 min。

胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）液體培養基（用于發酵培養）參照文獻[19]配制：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，丁二酸鈉5.0 g，蒸餾水加至1 L，HCl調至pH 6.8，121℃濕熱滅菌15 min。

硝基還原酶活性檢測培養基（用于檢測乳酸菌的硝基還原酶活性）：蛋白胨10.0 g，硝酸鉀1.0 g，加蒸餾水至1 L，pH值調至pH 7.4，121℃滅菌15 min。

氨基酸脫羧酶檢測培養基（用于檢測乳酸菌是否產生生物胺）：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉0.25 g，葡萄糖0.5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳2.0 g，硫酸亞鐵0.04 g，檸檬酸銨2 g，維生素B1 0.01g，磷酸氫二鉀2.0 g，碳酸鈣0.1 g，磷酸吡哆醛0.05 g，吐溫-80 0.06 g，溴甲酚紫0.06 g，蒸餾水加至1 L，調至pH 5.8～6.0，121℃濕熱滅菌15 min。

酪胺、組胺、尸胺或腐胺檢測培養基，是在上述培養基中分別添加10.0g的酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。

1.1.3 試劑

γ-氨基丁酸（GABA）標準品：美國Sigma公司；L-谷氨酸：國藥集團化學試劑有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養基：貝瑞特生物技術有限責任公司；三乙胺、正己烷、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀：安捷倫（中國）科技有限公司；AE200分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DM2500顯微鏡：上海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II生化培養箱：上海躍進醫療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BXM-30R全自動高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器北京有限公司；TGL-20bR離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，在37℃條件下培養于mMRS培養基中。試驗前用mMRS液體培養基至少活化3次。大腸桿菌培養在LB培養基中，金黃色葡萄球菌培養在TSB培養基中，均采用37℃恒溫培養。

1.3.2 產γ-氨基丁酸乳酸菌發酵液的制備

將活化后的乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養基中，37℃靜置培養48 h，將發酵液離心后取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后得無菌上清液，供HPLC檢測分析。

（1）單因素試驗條件優化

分別考察不同發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、初始pH值（pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、發酵溫度（28℃、31℃、34℃、37℃、40℃）以及接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對乳酸菌發酵液中GABA積累量的影響。

（2）正交試驗條件優化

在單因素試驗的基礎上，選取發酵時間、發酵溫度、初始pH值和接種量為影響因素，以GABA含量為評價指標，采用L9（34）正交設計優化，試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.3 乳酸菌發酵液γ-氨基丁酸的檢測

（1）高效液相色譜條件

色譜柱采用Syncronis-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為50 mmol/L醋酸鈉（pH 6.5）-5%乙腈溶液，流動相B為80%乙腈溶液，流速1.0 mL/min，柱溫為35℃進行梯度洗脫，洗脫梯度程序見表2；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為254 nm，進樣量10 μL。

表2 分離γ-氨基丁酸梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for γ-aminobutyric acid separation

（2）衍生化處理

取標準品溶液或供試無菌上清液200 μL，加入3 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL、0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置1 h，加入400 μL正己烷充分混勻，靜置10 min，取下層溶液，再次加入400 μL正己烷，充分混勻，靜置10 min。吸取下層溶液，經0.45 μm濾膜過濾，取20 μL樣品進樣進行色譜分析。

1.3.4 硝基還原酶活性檢測

供試菌株按1%接種量接種于硝基還原酶檢測培養基中，37℃恒溫培養72 h，依次向發酵培養液中加入α-萘胺溶液和對氨基苯甲磺酸溶液，觀察培養基顏色的變化。大腸桿菌ATCC 25922為陽性對照菌株。未接種細菌的硝基還原酶檢測培養基為空白對照。

1.3.5 生物胺產生能力檢測

供試菌株接種于含0.1%氨基酸（酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸）和0.005%的5′-磷酸吡哆醛的MRS液體培養基中，37℃靜置培養48 h，連續轉接10代，分別劃線于酪胺、組胺、尸胺、腐胺檢測培養基，37℃培養72 h后觀察菌落周圍培養基顏色的變化。同空白培養基相比，若培養基呈黃色則為陰性結果；若培養基呈紅色或紫色則為陽性結果。

1.3.6 吲哚試驗

供試菌株接種于蛋白胨水培養基中，37℃恒溫培養72 h，加入吲哚試劑8～10滴觀察顏色變化。若液面出現玫瑰紅色則為陽性結果，否則為陰性結果。大腸桿菌ATCC 25922為陽性對照菌株。未接種細菌的蛋白胨水培養基為空白對照。

1.3.7 溶血試驗

供試菌株劃線接種于含質量濃度5 g/100 mL人體血液的哥倫比亞瓊脂平板上，37℃培養48 h，觀察菌落周圍變化情況。若菌落周圍形成透明圈則為β-溶血；若出現綠色圈，則為α-溶血；若無溶血環，則為γ-溶血，也稱無溶血。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽性參照菌株。

2 結果與分析

2.1 菌株HUCM 201發酵液中GABA的定量分析

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株培養于含1%谷氨酸的TYG培養基中，培養48 h后，采用柱前衍生化高效液相色譜方法對發酵液中GABA含量進行測定，GABA標準品及菌株發酵液的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 γ-氨基丁酸標準品（A）以及發酵液（B）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of γ-aminobutyric acid standard(A)and fermentation broth(B)

從圖1可知，發酵液中GABA與其他雜質通過該方法可有效分開，GABA的保留時間為16.0 min左右。通過外標法以峰面積定量可知，菌株HUCM 201在含1%谷氨酸的TYG液體培養基中37℃發酵48 h后，發酵液中GABA的質量濃度可達95.3 μg/mL。

2.2 菌株HUCM 201產GABA條件優化單因素試驗

2.2.1 發酵時間對GABA產量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養基中，37℃靜置培養，于不同時間點取發酵液，并經處理后供HPLC檢測GABA含量，結果如圖2所示。

由圖2可知，GABA含量隨發酵時間的增加呈上升趨勢，菌株HUCM201發酵60 h后，發酵液中GABA累積量趨于平穩，60h時GABA含量為134.8μg/mL，72h時為138.7μg/mL，二者差異不顯著。故最佳發酵時間為60 h。

圖2 發酵時間對γ-氨基丁酸產量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on γ-aminobutyric acid production

2.2.2 初始pH值對GABA產量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于不同初始pH值的含1%谷氨酸的TYG液體培養基中，37℃靜置培養60 h，發酵液經處理后供HPLC檢測GABA含量，結果如圖3所示。

圖3 初始pH值對γ-氨基丁酸產量的影響Fig.3 Effect of initial pH on γ-aminobutyric acid production

由圖3可知，GABA含量隨初始pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，在初始pH值為6.0時，發酵液中GABA累積量最大，達到149.4 μg/mL，故最佳初始pH值為6.0。

2.2.3 發酵溫度對GABA產量的影響

菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養基（pH 6.0）中，不同溫度下靜置培養60 h，發酵液經處理后供HPLC檢測GABA含量，結果如圖4所示。

圖4 發酵溫度對γ-氨基丁酸產量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on γ-aminobutyric acid production

由圖4可知，隨著培養溫度的升高，GABA含量首先隨之升高，培養溫度為31℃時，菌株HUCM 201發酵液中GABA累積量最大，GABA含量達到191.2 μg/mL，發酵溫度超過31℃后GABA產量出現明顯下降。故最佳發酵溫度為31℃。

2.2.4 接種量對GABA產量的影響

圖5 接種量對γ-氨基丁酸產量的影響Fig.5 Effect of inoculum on γ-aminobutyric acid production

菌株HUCM 201按不同接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養基（pH 6.0）中，31℃靜置培養60 h，發酵液經處理后供HPLC檢測GABA含量，結果如圖5所示。

由圖5可知，接種量為3%時，菌株HUCM 201發酵液中GABA累積量最大，GABA含量達到213.4μg/mL，接種量超過3%后GABA產量無明顯變化。故最佳接種量為3%。

2.3 發酵條件的優化正交試驗

根據單因素條件優化結果，選擇發酵時間、初始pH值、發酵溫度、接種量4個因素，以GABA產量為評價指標，按照L9（34）正交表進行正交試驗，優化結果如表3所示。

表3 發酵條件優化正交試驗優化結果分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表3結果可知，對GABA產量影響大小依次為發酵溫度＞發酵時間＞接種量＞初始pH值，最佳組合為A2B3C2D3，以此為最佳發酵條件進行發酵，即菌株HUCM 201按4%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養基（pH 6.5）中，31℃培養60 h，GABA的產量達到218.7 μg/mL。

2.4 硝基還原酶活性檢測結果

圖6 硝基還原酶活性檢測結果Fig.6 Determination results of nitroreductase activity

菌株的硝基還原酶活性檢測結果如圖6所示。由圖6可知，接種大腸桿菌ATCC 25922的培養基顏色變成了紅色，為陽性結果；而接種HUCM 201菌株的培養基顏色并未發生變化，其硝基還原酶活性試驗結果呈陰性，說明菌株HUCM 201不能產生硝基還原酶，不會將環境中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽進而產生有害代謝物。

2.5 生物胺產生能力檢測結果

生物胺產生能力的檢測結果如圖7所示。由圖7可知，菌株HUCM201連續轉接于含0.005%的5′-磷酸吡哆醛和0.1%酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸其中一種氨基酸的MRS液體培養基10代后，分別劃線接種于酪胺、組胺、尸胺或腐胺檢測培養基，經培養后，4種培養基均呈現為黃色，說明該菌株在生長過程中并未產生堿性物質而使培養基呈現紫色或紅色，均為陰性結果。由此說明，菌株HUCM201在生長過程中并不會產生酪胺、組胺、尸胺或腐胺的有害代謝產物。

圖7 菌株HUCM 201產生物胺的檢測結果Fig.7 Determination results of biogenic amines production by strain HUCM 201

2.6 吲哚試驗結果

供試菌株于37℃培養于蛋白胨水培養基中72h后，加入吲哚試劑檢測吲哚產生情況，結果如圖8所示。由圖8可知，加入吲哚試劑后，大腸桿菌ATCC25922發酵液的液面出現玫瑰紅色，呈陽性結果；而菌株HUCM 201發酵液的液面顏色未發生變化，為陰性結果。由此說明，菌株HUCM201在生長過程中不會代謝產生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。

圖8 吲哚試驗結果Fig.8 Results of indole experiments

2.7 溶血試驗結果

溶血試驗結果如圖9所示，供試菌株于哥倫比亞血瓊脂平板上37℃培養48 h后，金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌落周圍出現了透明圈，發生了β-溶血，而菌株HUCM 201菌落周圍無溶血環出現，為γ-溶血，即不溶血。由此說明，菌株HUCM 201無溶血能力，不會引起人體出現溶血。

圖9 溶血試驗結果Fig.9 Results of haemolysis experiments

由上述硝基還原酶試驗、生物胺產生能力檢測、吲哚試驗以及溶血試驗的結果可知，菌株HUCM 201為硝基還原酶陰性、吲哚試驗陰性、無溶血、不能產生酪胺、組胺、尸胺以及腐胺生物胺類有害代謝物，可初步判定其為一株安全的益生菌。

3 結論

乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株在其生長代謝過程中能產生重要的活性物質—γ-氨基丁酸，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化了其產GABA的發酵條件，菌株HUCM 201按4%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG培養基（pH 6.5）中31℃發酵60 h，其發酵液中GABA的質量濃度可達218.7 μg/mL，并且該菌株不能代謝產生硝基還原酶，不能產生酪胺、組胺、尸胺或腐胺生物胺類有害代謝物，也不能利用色氨酸產生吲哚有害代謝物，不會引起人體血液發生溶血，可初步認為是一株較為安全的益生菌，但菌株HUCM 201作為益生菌應用前仍需做更為全面系統的安全性評價。

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γ-aminobutyric acid-producing ability and safety evaluation ofLactococcus lactis

MENG Dan1,WANG Liqun2,XIE Guoliang1,LIU Xiaoyan1,YU Chunmiao1,GUO Lidong1*
(1.College of Pharmacy,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China; 2.Food Processing Institute,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

The γ-aminobutyric acid-producing ability ofLactococcus lactissubsp.lactisHUCM 201 was discussed and the strain safety was preliminarily evaluated.Using γ-aminobutyric acid concentration as evaluation index,the optimal fermentation condition of strain HUCM 201 was evaluated by orthogonal experiments.The optimal fermentation condition was inoculum 4%,initial pH 6.5,fermentation temperature 31℃and time 60 h.The γ-aminobutyric acid concentration was determined as 218.7 μg/ml based on the optimal fermentation condition.Moreover,the safety ofL.lactissubsp. lactisHUCM 201 was evaluated via nitroreductase activity determination,biogenic amines production analysis,indole experiments and haemolysis experiments.The results suggested that the strain HUCM 201 was a nitroreductase-negative,indole-negative,haemolysis-negative bacterium,and could not produce biogenic amines,such as tyramine,histamine,cadaverine,and putrescine.Thus,L.lactissubsp.lactisHUCM 201 was preliminarily considered as safe probiotic bacterium.

lactic acid bacteria;γ-aminobutyric acid;biogenic amine;safety

TS201.3

0254-5071（2017）04-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.016

2016-07-04

黑龍江省自然科學基金項目（C2016052）；黑龍江省教育廳面上項目（12531631）；黑龍江中醫藥大學校科研基金項目（201104）

孟丹（1978-），女，講師，碩士，研究方向為食品營養與衛生。

*通訊作者：國立東（1982-），男，副教授，博士，研究方向為功能食品與食品生物技術。