濃香型白酒窖泥梭菌的分離及其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

何培新，李芳莉，鄭燕，張勇，胡曉龍*，孫西玉，郭福利

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；3.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南寧陵476733）

濃香型白酒窖泥梭菌的分離及其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析

何培新1，李芳莉1，鄭燕1，張勇1，胡曉龍1*，孫西玉2，3，郭福利3

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；3.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南寧陵476733）

從河南張弓老酒酒業(yè)的窖泥中分離厭氧梭菌屬細(xì)菌，基于微生物16S rRNA基因序列分析對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定；采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)萃取和檢測(cè)了分離菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，分離到的88株細(xì)菌與基因庫(kù)中8種芽孢梭菌（Clostridium celerecrescens、C.cochlearium、C.carboxidivorans、C.sporogenes、C.sartagoforme、C.thermopalmarium、C.aurantibutyricum和C.butyricum）具有較高的序列同源性。從分離菌株的發(fā)酵液中共檢測(cè)到20種酯類、12種酸類、11種醇類和4種醛類物質(zhì)，還有一部分酮類和醚類物質(zhì)；其中主要的酯類物質(zhì)有丁酸乙酯、丁酸丁酯、3-苯丙酸乙酯等，酸類物質(zhì)主要為丁酸和己酸，醇類物質(zhì)主要為丁醇、己醇和3-苯丙醇。本研究有助于進(jìn)一步揭示窖泥中可培養(yǎng)梭菌菌群對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)。

濃香型白酒；窖泥；厭氧梭菌；16S rRNA基因；揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

濃香型白酒以窖池為發(fā)酵容器，采用半開(kāi)放式多菌種協(xié)同固態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)，窖泥微生物對(duì)白酒品質(zhì)改善及特征香氣的形成具有重要的影響[1-2]。窖泥微生物的種類繁多，包括細(xì)菌、古生菌、放線菌、霉菌和酵母菌等，其中以細(xì)菌和古生菌為主[3]。窖泥微生物的數(shù)量、群落組成及其多樣性、種群間的相互作用及代謝產(chǎn)物的多樣性直接影響著窖泥的質(zhì)量及窖泥微生態(tài)平衡，進(jìn)而影響濃香型白酒的品質(zhì)。在窖泥微生物群落中，厭氧梭菌一直被認(rèn)為是影響白酒風(fēng)味物質(zhì)形成的重要微生物，如產(chǎn)己酸梭菌（Clostridium kluyveri）、產(chǎn)丁酸梭菌（C.butyricum）和酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）等[4-5]。由于己酸是形成濃香型白酒特征香氣物質(zhì)己酸乙酯的重要前體物質(zhì)，許多關(guān)于窖泥中梭菌的研究主要集中于產(chǎn)己酸梭菌的分離培養(yǎng)及其在窖泥護(hù)理與制備中的應(yīng)用[6]。然而，對(duì)其他可培養(yǎng)梭菌的分離、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物的研究較少。本研究分離和初步鑒定了濃香型白酒窖泥中的厭氧梭菌，并分析了分離菌株發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類，對(duì)提高白酒品質(zhì)、開(kāi)發(fā)新型白酒產(chǎn)品等具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品采自河南張弓老酒酒業(yè)股份有限公司65年和45年窖齡的窖池，分別于窖池底部和窖壁中部處取樣。將上述樣品分別裝入相應(yīng)無(wú)菌取樣袋中，并置冰盒中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、醋酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、巰基乙酸鈉、碳酸鈣、乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。所有試劑均為分析純。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（reinforcedclostridiummedium，RCM）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化鈉5 g，醋酸鈉3 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min，pH自然。

RCM固體培養(yǎng)基：RCM液體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem，ES）液體培養(yǎng)基：乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸銨0.5 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.3 g，巰基乙酸鈉0.3 g，碳酸鈣10 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min，接種前加入乙醇20 mL。

ES固體培養(yǎng)基：ES液體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；C1000TouchTMPCR、紫外凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；C-312.5L密封培養(yǎng)罐及厭氧產(chǎn)氣袋C-1：日本三菱集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 窖泥梭菌的分離培養(yǎng)

稱取窖泥樣品10 g，加入盛有100 mL無(wú)菌水及10粒玻璃珠（φ=3 mm）的三角瓶中，25℃、200 r/min振蕩20 min。將窖泥懸浮液于80℃水浴10 min殺死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，分別接種體積分?jǐn)?shù)5%于100 mL RCM和100 mL ES液體培養(yǎng)基，37℃富集培養(yǎng)4～6 d。將富集培養(yǎng)液采用10倍系列稀釋，吸取10-4～10-7稀釋度的菌懸液200 μL涂布于相應(yīng)的RCM和ES平板，每個(gè)稀釋度涂布三板。接種后的平板置密封培養(yǎng)罐內(nèi)，37℃培養(yǎng)3 d。對(duì)各種不同特征的菌落進(jìn)行平板劃線純化，獲得單菌落[7]。

1.3.2 細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)

將分離的梭菌菌株單菌落接種15 mL RCM或ES液體培養(yǎng)基（分裝于20 mL的大試管中），置厭氧袋內(nèi)，37℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h，用作種子液。吸取種子液，按5%的接種量接種至100 mL RCM和ES液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)4～6 d。吸取適量發(fā)酵液分別用于細(xì)菌基因組DNA提取和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)。

1.3.3 DNA的提取、PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

吸取細(xì)菌發(fā)酵液2 mL置于無(wú)菌EP管中，10 000 r/min離心3 min，棄去上清液。菌體沉淀采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）并按操作步驟提取基因組DNA。

利用16S rRNA基因通用引物27 F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCA-3′）和1492 R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。擴(kuò)增體系如下：1 μL引物27F（10 μmol/L），1 μL引物1492R（10 μmol/L），0.15 μLTaq酶（5 U/μL），2.5 μL 10×buffer，4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5 mmol/L），1 μL DNA模板，加無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段約為1500bp。利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）回收目的片段，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司測(cè)序（上海生工）。將測(cè)得的細(xì)菌16S rRNA基因序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并將測(cè)定菌株的16SrRNA基因序列與其同源性最高的序列采用Mega 5.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）[9]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.4 細(xì)菌發(fā)酵液的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析

取菌株發(fā)酵液15 mL，在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液8 mL加入萃取瓶中，加入3 g氯化鈉和5 μL的薄荷醇（100 μg/L內(nèi)標(biāo)液），并加入一個(gè)小磁力轉(zhuǎn)子，采用頂空固相微萃取法萃取發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)，所用的萃取頭為50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Supelco），50℃磁力攪拌恒溫水浴鍋萃取30 min，轉(zhuǎn)速400 r/min；然后將萃取頭插入進(jìn)樣口熱解吸附5 min，溫度260℃。氣相色譜條件為：安捷倫HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230℃，氦氣流速1.0 mL/min。升溫程序?yàn)椋?0℃保持2 min，以4℃/min的速率升溫至230℃保持15 min，然后235℃保持5min。質(zhì)譜條件為：電子電離（electronionization，EI）源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 617 V，質(zhì)量掃描范圍50～550 u，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及窖泥可培

養(yǎng)厭氧梭菌種群分析

根據(jù)菌株菌落形態(tài)差異，從各種分離平板上生長(zhǎng)的菌落共挑取120株細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定。將測(cè)定細(xì)菌的16SrRNA基因序列提交NCBI進(jìn)行在線比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖1），發(fā)現(xiàn)除少數(shù)菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）以外，其余88株與GenBank中8種芽孢梭菌（Clostridium）顯示＞91%的序列同源性（見(jiàn)表1）。

圖188 株厭氧梭菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Polygenetic tree of 88 anaerobicClostridiumspp.

表1 窖泥中分離厭氧梭菌的種類及數(shù)量Table 1 Species and quantity of anaerobicClostridiumspp.isolated from pit mud

從表1可以看出，5株代表菌株（R50D1、R50D4、R50 zhong 1、R50 zhong 7和E70D11）與基因庫(kù)中相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列的同源性為97%及以上，因而可將這些菌株初步鑒定到種的水平，分別為C.celerecrescens、C.cochlearium、C.carboxidivorans、C.sporogenes和C.bu tyricum。其他3個(gè)菌株（R50zhong10、E50zhong4和R70D1）與基因庫(kù)中最高相似菌菌株16S rRNA基因序列的同源性僅為91%～97%之間，表明這些菌株可能屬于梭菌屬或其近緣屬中的新種[10]。分離菌株的分類地位有待于結(jié)合其他分類學(xué)特征進(jìn)一步確證。此外，本研究從窖泥中分離到8種芽孢梭菌，遠(yuǎn)低于基于高通量測(cè)序認(rèn)識(shí)的梭菌種類[11]。其原因可能是窖泥本身就是一個(gè)低氧、高酒精度、高有機(jī)物（有機(jī)酸、醇類、酯類及酚類等）含量、多種微生物相互作用的一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，其中大量微生物（包括梭菌）難以獨(dú)立人工培養(yǎng)。

本研究采用RCM和ES兩種培養(yǎng)基分離窖泥中的厭氧梭菌，C.carboxidivorans、C.sartagoforme和C.aurantibutyricum采用RCM培養(yǎng)基分離得到，C.thermopalmarium和C.butyricum采用ES培養(yǎng)基分離得到，其他菌株采用兩種培養(yǎng)基均可分離獲得。兩種培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和環(huán)境條件（pH等）不同，因而對(duì)窖泥中的梭菌產(chǎn)生了不同的影響。該結(jié)果也暗示，采用不同的培養(yǎng)基組合，可能會(huì)從濃香型白酒窖泥中分離得到更多的可培養(yǎng)梭菌，從而豐富對(duì)窖泥中梭菌多樣性的認(rèn)識(shí)。

從表1可以看出，分布于65年窖池窖泥樣品中可培養(yǎng)梭菌種類與45年窖泥樣品有所不同，主要原因可能是窖泥的理化性質(zhì)隨著窖齡的增加呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化[12]，進(jìn)而促使其中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)地改變[13]。其中C.celerecrescens、C.cochlearium和C.sporogenes在不同窖齡窖池的窖泥中均有出現(xiàn)，且C.celerecrescens和C.sporogenes為窖泥中優(yōu)勢(shì)可培養(yǎng)梭菌。C.carboxidivorans、C.sartagoforme和C.thermopalmarium是65年窖池窖泥特有梭菌，而C.auran-tibutyricum和C.butyricum是45年窖池窖泥特有梭菌。梭菌是高齡窖池窖泥的主要微生物類群，對(duì)維持窖泥的微生態(tài)平衡及保持濃香型白酒風(fēng)格特征具有重要作用[14]。如C.celerecrescens具有降解纖維素的能力。在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中有利于將發(fā)酵原料或輔料（谷物皮及稻殼等）中的纖維素降解為小分子有機(jī)物，同時(shí)也有助于發(fā)酵谷物中淀粉等物質(zhì)的釋放，進(jìn)而為其他微生物的生長(zhǎng)繁殖提供可利用的碳氮源[15]。C.butyricum的代謝物丁酸可以作為濃香型白酒重要風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)還可以作為微生物合成己酸的電子受體，進(jìn)而有利于濃香型白酒主體香味物質(zhì)己酸乙酯的形成[16]。

2.2 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性代謝物質(zhì)分析

采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用的方法對(duì)篩選梭菌的發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)萃取和分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，8種芽孢梭菌的揮發(fā)性代謝物主要包括20種酯類（乙酸乙酯、乙酸己酯、甲酸甲酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、丁酸丁酯、戊酸丁酯、異戊酸丁酯、異丁酸異戊酯、異戊酸異戊酯、己酸丙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、苯丙氨酯、乙酸癸酯、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、棕櫚酸乙酯、棕櫚酸異丙酯）、12種酸類（2,3-二羥基丁二酸、乙酸、丁酸、異戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、草莓酸、庚酸、辛酸、反油酸、癸酸、十一酸）、11種醇類（丁醇、1-戊醇、正己醇、4-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-1-己醇、苯乙醇、1-辛醇、3-苯丙醇、1-癸醇、1-十四醇）和4種醛類（苯乙醛、癸醛、壬醛、肉豆蔻醛），此外還有2種酮類（2-壬酮、苯乙酮）、1種醚類（二甲基四硫醚）、2種苯并雜環(huán)化合物（吲哚、2,3,5,6-四甲基吡嗪）和2種含硫類化合物（二甲基二硫、二甲基三硫）。這些結(jié)果表明，分離得到的梭菌具有發(fā)酵產(chǎn)生多種白酒風(fēng)味物質(zhì)或其前體物質(zhì)的能力，對(duì)濃香型白酒香味物質(zhì)的形成具有重要的影響。與濃香型白酒原酒風(fēng)味物質(zhì)相比，分離梭菌在RCM和ES培養(yǎng)基上產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的種類較少[17]。原酒生產(chǎn)采用多種糧食原料和高溫曲作用，在具有復(fù)雜微生物群落的窖池中經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的釀造而成。窖泥中含有己酸菌和丁酸菌等多種功能細(xì)菌，將釀造過(guò)程中產(chǎn)生的酸類和醇類等前體物質(zhì)，通過(guò)酯化作用反應(yīng)生成己酸乙酯、丁酸乙酯等白酒重要風(fēng)味物質(zhì)[18]。

表2 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of GC-MS analysis of volatile components ofClostridumspp.fermentation broth

梭菌R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）、R50zhong7（C.sporogenes）、R50zhong10（C.sartagoforme）和R70D1（C.aurantibutyricum）的RCM發(fā)酵液酸類物質(zhì)所占比例較大，其中丁酸的含量較高，菌株R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）的RCM發(fā)酵液中丁醇的含量相對(duì)較高（表2）。作為白酒的四大酸之一，丁酸可在窖泥中的一些霉菌、酵母菌及乳酸菌產(chǎn)生的酯化酶的作用下，與乙醇和丁醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成丁酸乙酯和丁酸丁酯。丁酸乙酯作為濃香型白酒四大酯類物質(zhì)之一，具有濃郁的甜果香風(fēng)味，直接影響白酒的口感。R50zhong7（C.sporogenes）的RCM發(fā)酵液含有少量的具有甜香味的2,3,5,6-四甲基吡嗪，R50D1（C.celerecrescens）、R50 zhong 1（C.carboxidivorans）的RCM發(fā)酵液中含有具有具有咸菜風(fēng)味的二甲基二硫和二甲基三硫，有助于白酒特征風(fēng)味物質(zhì)的形成[19]，菌株E50 zhong 1（C.sporogenes）、E50 zhong 3（C.celerecrescens）、E50 zhong 4（C.thermopalmarium）、E70D5（C.cochlearium）和E70D11（C.butyricum）的ES發(fā)酵液含有較高比例的吲哚。吲哚具有強(qiáng)烈的糞便臭味，含量過(guò)高將在很大程度上降低濃香型白酒的品質(zhì)。通過(guò)不同的液體培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，由于培養(yǎng)基成分的不同，其發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)有很大的差別。菌種C.celerecrescens（R50D1）、C.cochlearium（R50D4）和C.sporogenes（R50zhong7）的RCM發(fā)酵液中含有較高含量的丁酸，C.celerecrescens（E50 zhong 3）、C.cochlearium（E70D5）和C.sporogenes（E50 zhong 1）的ES發(fā)酵液中含有較高比例的醇類，以丁醇的含量相對(duì)較高，還有一定比例的吲哚。因此，這些分離菌株用于白酒釀造，必須進(jìn)行進(jìn)一步的菌種選育或者發(fā)酵條件優(yōu)化等工作，以盡量降低發(fā)酵產(chǎn)生吲哚物質(zhì)。

比較分析梭菌發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對(duì)含量，可以更具體地了解窖泥中部分梭菌的代謝性質(zhì)及其代謝產(chǎn)物對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響，為生產(chǎn)與維護(hù)窖泥、改善白酒品質(zhì)，尤其是在提高液態(tài)法生產(chǎn)白酒的品質(zhì)等方面提供一定理論支撐和技術(shù)指導(dǎo)。傳統(tǒng)固態(tài)法白酒釀造是一個(gè)多種微生物相互作用的過(guò)程，微生物多樣性是白酒風(fēng)味物質(zhì)復(fù)雜性的重要原因。而液態(tài)法生產(chǎn)白酒僅人工接種少數(shù)微生物，造成液態(tài)法白酒中的酸類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量較少。采用多種產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的細(xì)菌和產(chǎn)香酵母混合發(fā)酵，會(huì)有效增加釀造白酒的風(fēng)味物質(zhì)種類和濃度。在液態(tài)法白酒生產(chǎn)以及固態(tài)法釀造的窖泥維護(hù)和改造中，添加多種能產(chǎn)生白酒風(fēng)味物質(zhì)的窖泥微生物，將會(huì)有效提高白酒品質(zhì)，提高優(yōu)質(zhì)品率，增加企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

從濃香型白酒不同窖齡窖池的窖泥中分離出多株厭氧芽孢梭菌，采用16S rRNA基因序列分析技術(shù)初步確定了8株代表性梭菌的分類地位。將8株芽孢梭菌分離物進(jìn)行人工發(fā)酵，采用GC-MS分析了發(fā)酵液中的揮發(fā)性代謝物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些菌株均可產(chǎn)生多種濃香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)或其前體物質(zhì)。菌株R50D1（C.celerecrescens）、R50D4（C.cochlearium）、R50zhong7（C.sporogenes）、R50zhong10（C.sartagoforme）和R70D1（C.aurantibutyricum）在RCM液體培養(yǎng)基中的代謝物主要為丁酸；菌株E50 zhong 1（C.sporogenes）、E50 zhong 3（C.celerecrescens）、E50 zhong 4（C.thermopalmarium）、E70D5（C.cochlearium）和E70D11（C.butyricum）的ES發(fā)酵液中具有強(qiáng)烈糞便臭味的吲哚的相對(duì)含量較高。窖泥中厭氧梭菌的分離、鑒定及其揮發(fā)性代謝物分析，可為有效改善窖泥質(zhì)量、生物強(qiáng)化白酒風(fēng)味物質(zhì)、溯源及控制白酒異嗅物質(zhì)及開(kāi)發(fā)液態(tài)法白酒生產(chǎn)菌種等提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

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Isolation and volatile metabolites ofClostridiumspp.in pit mud of strong-flavorBaijiu

HE Peixin1,LI Fangli1,ZHENG Yan1,ZHANG Yong1,HU Xiaolong1*,SUN Xiyu2,3,GUO Fuli3
(1.School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450001,China; 2.School of Biological Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450001,China; 3.Henan Zhanggong Laojiu Wine Co.,Ltd.,Ningling 476733,China)

AnaerobicClostridiumspp.were isolated from pit muds at Henan Zhanggong Laojiu,and identified based on 16S rRNA gene sequence analysis.The volatile metabolites of these isolates were extracted by HS-SPME and determined by GC-MS.The results suggested that the 88 bacterial strains showed high sequence similarities with 8Clostridiumspp.in GenBank,includingClostridium celerecrescens,C.cochlearium,C.carboxidivorans,C.sporogenes,C.sartagoforme,C.thermopalmarium,C.aurantibutyricum,andC.butyricum.A total of 20 esters,12 acids,11 alcohols and 4 aldehydes,and some ketones and ethers were detected from the metabolites ofClostridiumspp.fermentation broth.Among them,ethyl butyrate, butyl butyrate and 3-benzene ethyl propionate were dominant esters;butyric acid and caproic acid were dominant acids;butanol,hexanol and 3-phenylpropanol were main alcohols.The study was helpful to reveal the contribution of the cultivableClostridiumspp.from pit mud to the flavor constitution of strong-flavorBaijiu(Chinese liquor).

strong-flavorBaijiu;pit mud;anaerobicClostridium;16S rRNA gene;volatile metabolites

TS261.1

0254-5071（2017）04-0045-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.010

2016-12-09

鄭州輕工業(yè)學(xué)院研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（ZQ2015-3738）；中國(guó)輕工業(yè)濃型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（2017JJ012）

何培新（1970-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：胡曉龍（1984-），男，講師，博士，研究方向?yàn)榘拙漆勗旃こ獭?/p>