環境因素對屎腸球菌產酪胺的影響

王俊朋，呂曉玲，張穎，朱曉娟，張健*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

環境因素對屎腸球菌產酪胺的影響

王俊朋1，呂曉玲1，張穎1，朱曉娟2，張健2*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全教育部重點實驗室，天津300457；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

酪胺是發酵食品中廣泛存在的、毒性較強的一種生物胺。屎腸球菌作為發酵劑或污染菌廣泛存在于發酵食品中，大多數具有產生酪胺的能力，成為發酵食品的潛在安全隱患。該研究以一株黃酒酒曲中分離的產酪胺屎腸球菌為對象，選取葡萄糖、酪氨酸、溫度、pH值和酒精含量5個因素，研究這些因素對該菌生長和酪胺合成的影響。結果表明，葡萄糖或酪氨酸添加量對菌體的生長影響不大，溫度、環境pH值和酒精含量對菌體生長的影響較顯著。酪氨酸對菌體產酪胺促進作用明顯，溫度＜20℃，環境pH值＞5，酒精含量＞10%vol時都會減少酪胺的產生。

屎腸球菌；酪胺；環境因素；菌體生長；黃酒

生物胺是一類含氮的具有生物活性的小分子量有機化合物的總稱。根據結構可以將其分成三類：脂肪族（如腐胺，尸胺、精胺、亞精胺等）；芳香族（如章魚胺、酪胺、苯乙胺等）；雜環族（如組胺、色胺等[1]）。適量的生物胺在生物體內具有重要的生理作用，但是當人體吸收過量的生物胺時，將產生一系列應激反應，甚至死亡。

黃酒是我國特有的傳統酒種，開放式多菌種發酵方式使其中生物胺含量遠高于葡萄酒或啤酒等其它發酵酒。雖然，目前沒有黃酒中生物胺的限量標準，但是很多學者建議酒精飲料中組胺的中毒劑量為8～20 mg/L，酪胺的中毒劑量為25～40 mg/L[2-7]。前期調研以及文獻報道表明，很多黃酒產品中的酪胺含量高于此標準，這使得黃酒的飲用安全受到一些質疑，影響了黃酒產品的推廣和出口創匯。

酪胺是黃酒中的主要生物胺之一，也是毒性僅次于組胺的生物胺，在人體內大量積累會引起偏頭痛和高血壓，嚴重時會導致腦溢血。酪胺是由酪氨酸脫羧酶將酪氨酸脫羧轉化而成的，酪氨酸脫羧酶廣泛存在于腸球菌屬細菌中[5]，因此腸球菌屬細菌是最常見的酪胺產生菌。本實驗室前期從黃酒酒曲中分離鑒定了一株屎腸球菌（Enterococcus faecalis），具有很強的酪胺合成能力。前期，也有學者從發酵肉制品、奶酪等產品中分離到了產酪胺的屎腸球菌。

通常認為，屎腸球菌是腸系菌群平衡的關鍵菌株，具有較好的抑菌效果和降膽固醇等益生功能，同時也在很多發酵食品的成熟和風味形成中發揮重要作用[6]。同時，一些屎腸球菌也被醫院公認為是引起血癥、心內膜炎、泌尿道和其他感染的病原體[8-10]。由于這些菌株可以生存在高鹽濃度，低pH值和高溫的環境中，在食品加工過程中很難完全滅活[11-12]。

鑒于屎腸球菌在眾多發酵制品中的重要作用，有必要深入研究環境因素對該菌種合成酪胺的影響。為此，本試驗選取葡萄糖、酪氨酸、溫度、pH值和酒精含量5個因素，結合黃酒發酵過程設置不同水平，研究這些環境因素對屎腸球菌生長和酪胺合成的影響。真實的黃酒發酵過程是多菌種開放式發酵[13-14]，其中酪胺的形成除與上述因素有關，還受原料、菌群互相作用等因素的影響，且黃酒中存在多種酪胺產生菌，酪胺的形成非常復雜。因此本研究并不能完全反映黃酒發酵過程中環境因素對酪胺形成的影響，但是可為屎腸球菌為主要發酵菌種生成酪胺的過程提供一些基礎參數，有助于理解黃酒發酵過程中酪胺的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌（Enterococcus faecalis）：從黃酒酒曲中分離。

乙腈（色譜純）：東莞市喬科化學有限公司；酪胺標準品：天津一方科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

MRS液體培養基：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母提取物4g/L，葡萄糖20g/L，乙酸鈉·3H2O 5 g/L，吐溫80 1 mL/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸三胺2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，酪氨酸0.5 g/L。

1.2 儀器與設備

Essentia PrepLC-16P高效液相色譜儀：日本島津公司；756PC紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；BCD-257SL冰箱：青島海爾有限股份公司；REGEND MICRO 17R小型高速離心機：美國Thermo公司；QL-901渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-B11-BY恒溫培養箱：上海躍進醫療有限公司；SY-1-2恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；CP64電子分析天平（精確至0.0001g）：奧豪斯儀器有限公司；Sartorius普及型pH計：Sartorius；0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器：北京華盛鼎國科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養條件

研究過程所用培養基是在MRS液體培養基加入0.05%的酪氨酸基礎上稍加修改，使研究的因素為液體培養基的單一變量。30℃條件下恒溫培養24 h，每4 h取樣。所有試驗的培養基的pH值控制在6.15～6.20范圍內。

因素水平為：（1）葡萄糖的添加量（5g/L、10g/L、15g/L、20 g/L）；（2）酪氨酸的添加量（0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L）；（3）溫度（20℃、25℃、30℃、35℃）；（4）pH值（4.5、5.0、5.5、6.2）；（5）酒精含量（0、5%vol、8%vol、10%vol）。

相應的液體培養基（10 mL MRS培養基加入0.05%的酪氨酸）接種體積分數1%的菌懸液，用試管在30℃條件下培養24 h，每4 h取樣，每組實驗設3個平行，在不同環境條件下培養之后，分別測定菌體的OD600nm值和酪胺產量。實驗技術路線如下：

菌體活化→制備菌懸液→接種菌懸液到不同因素水平的培養基進行恒溫培養→測定菌體OD600nm→測定發酵液中的酪胺含量

1.3.2 菌體生長曲線的測定

用分光光度法在波長600 nm處分別每4 h測定菌體OD值，當OD值＞0.7時樣液將被稀釋2～3倍，最后的吸光度值為測定值乘以稀釋倍數。

1.3.3 酪胺含量的測定

（1）生物胺的衍生

取發酵液1 mL置于10 mL的離心管中，加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液，加1 mol/L氫氧化鈉溶液調至pH 10，1 mL丹磺酰氯衍生溶液，振蕩混勻，置60℃水浴鍋內反應30 min，中間振蕩兩次，取出，加入100 μL氨水，振蕩混勻，60℃水浴鍋內反應30min，取出在40℃水浴下氮吹除去丙酮，加入3 mL乙醚振蕩2 min，靜置分層，吸取上清有機層，重復萃取兩邊，合并乙醚萃取液，氮氣吹干。加入1 mL乙腈使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22 μm濾膜針頭過濾，濾液待測。

（2）高效液相色譜測定

液相色譜參考條件色譜柱為Gemini 5u C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）柱，紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流動相A為超純水，流動相B為乙腈溶液，流速1 mL/min，按外標法以峰面積計算樣品的含量。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programs

2 結果與分析

2.1 酪胺標準曲線的制作以及衍生物色譜圖的繪制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL酪胺標品（100 mg/L），分別置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成一定濃度梯度的標準品，分別吸取上述標準系列和試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中測定峰面積，以酪胺質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，酪胺標準曲線見圖1，記錄色譜圖，酪胺衍生物的色譜圖見圖2。由圖1可知，標準曲線為y=130 000x+43 047，R2=0.999。由圖2可知，酪胺的保留時間約為17.0 min。

圖1 酪胺標準曲線Fig.1 Standard curve of tyramine

圖2 酪胺衍生物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of tyramine derivative

2.2 不同環境因素對菌體生長及產酪胺的影響

葡萄糖作為碳源是為微生物的生長繁殖提供提供營養物質和能量來源，氮源是生長過程中給微生物提供氮元素的物質，這些營養條件直接影響著菌體的生長繁殖，除此之外的發酵條件溫度、pH、酒精等對菌體的生長也有抑制或者促進作用。不同因素水平條件對屎腸球菌（E.faecalis）生長的影響見圖3。

由圖3可知，葡萄糖和酪氨酸的添加量對菌體生長動力學的影響不大，生長12 h均可達到穩定期，且培養24 h，OD值均可達到2.2左右；酒精含量對菌體生長抑制顯著，當酒精度＞8%vol時菌體生長幾乎停止；pH值對菌體生長動力學有顯著影響，pH值為4.5～6.2時菌體的生長速度明顯變快，穩定期的最大菌密度也呈現增加趨勢。在pH值4.5時菌體生長停止生長；溫度顯著影響菌體生長，隨著培養溫度的升高菌密度和生長速度都呈現增長趨勢。

酪胺是由酪氨酸脫羧酶催化轉化產生的。環境因素不僅對菌體生長有影響，還會影響菌體的產酶量以及酶的催化活性。這些都會影響發酵液中的酪胺含量。環境因素對發酵液中的酪胺含量的影響如圖4所示。

圖3 不同環境因素對屎腸球菌生長的影響Fig.3 Effect of different environmental factors onE.faecalisgrowth

圖4 不同環境因素對屎腸球菌產酪胺的影響Fig.4 Effect of different environmental factors on tyramine production byE.faecalis

由圖4可知，高含量的葡萄糖會導致穩定期后期酪胺的大幅減少，BUNKOVA L等[6]認為可能是由于在穩定期后期微生物代謝大量產酸抑制了菌體的生長，導致產胺量降低。但結合圖3a可知本實驗條件不會抑制菌體的生長，因此酪胺含量降低可能與產酶量減少或產酸導致酪氨酸脫羧酶活性降低所致；酪氨酸添加量不會改變酪胺的形成規律，即酪胺在8 h產量最高，隨后逐漸降低。但是隨著酪氨酸含量的增多，酪胺產量呈現遞增趨勢，酪氨酸的前體作用非常明顯。這與LINARES D M等[20]的報道一致；酒精含量＞8%vol時菌體幾乎停止生長，因此幾乎也無酪胺生成。但與添加5%vol的酒精相比不添加酒精生成的酪胺更多，即如圖3c所示不添加酒精更有利于菌體的生長。這說明少量的酒精對產酶或酶活有促進作用。pH4.5時酪胺產量隨時間呈現逐漸增加的趨勢，而如圖3d所示，此pH條件下菌體幾乎不能生長。酪胺的逐漸積累可能與酸性條件誘導菌體產酶有關，PEREZ M等[21]也有過類似的報道。中性條件下酪胺的含量并非最高，這也印證了酸性條件有利于菌體產酶。圖4e溫度對酪胺的影響主要體現在菌體的對數生長期，這個時期溫度越高酪胺的合成速度越快，產量也越高；但是培養24 h后，溫度對酪胺含量幾乎無影響。

3 結論

總體而言，葡萄糖或酪氨酸添加量對菌體的生長影響不大，溫度、pH值和酒精含量對菌體生長的影響較顯著。酪氨酸對菌體產酪胺促進作用明顯。溫度低于20℃，環境pH值＞5，酒精含量＞10%vol都會抑制酪胺的生成。由圖可知顯然菌體生長和酪胺的產生并非簡單的對應關系。酪胺的合成還受酪氨酸脫羧酶的產量和酶活的雙重影響。進一步對產酶量和酶活的研究將更為清晰的揭示環境條件對屎腸球菌（Enterococcus faecalis）合成酪胺的影響。本研究并不能完全反映黃酒發酵過程中環境因素對酪胺形成的影響，但是可為屎腸球菌為主要發酵菌種合成酪胺的過程提供一些基礎參數，這有助于理解黃酒發酵過程中酪胺的形成。

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Effect of environmental factors on tyramine production byEnterococcus faecalis

WANG Junpeng1,LV Xiaoling1,ZHANG Ying1,ZHU Xiaojuan2,ZHANG Jian2*
(1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Tyramine is a kind of strong toxic biogenic amines widely existed in fermented food.Enterococcus faecalis,as fermentation starter or contamination bacteria,is widely existed in fermented food,and most of them have the ability to produce tyrosine,which became potential safety hazard of fermented food.In the paper,using tyramine producing byE.faecalisisolated from Chinese rice wine as research objest,the effect of five factors including glucose,tyrosine,temperature,pH and alcohol content onE.faecalisgrowth and tyramine production was studied.Results showed that glucose or tyrosine addition had little effect on cell growth,while temperature,pH and alcohol content had significant effect on cell growth.Tyrosine can promote tyramine production apparently and tyramine production can be reduced under the condition of temperature＜20℃,or environment pH＞5,or alcohol content＞10%vol.

Enterococcus faecalis;tyramine;environmental factors;cell growth;Chinese rice wine

TS201.1

0254-5071（2017）04-0040-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.009

2016-12-05

國家自然科學基金資助項目（31471725）

王俊朋（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品添加劑與功能性配料。

*通訊作者：張健（1978-），男，副研究員，博士，研究方向為發酵食品安全。