肌酐水解酶菌株S-09發酵條件優化及酶的分離純化

石群，張慶芳，楊麗娜，任楠楠，喬慧，遲乃玉*

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622）

肌酐水解酶菌株S-09發酵條件優化及酶的分離純化

石群1，2，張慶芳1，2，楊麗娜1，2，任楠楠1，2，喬慧1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622）

該實驗以海洋來源的微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09為出發菌株，對其發酵培養基和產酶條件進行優化。并將粗酶液經硫酸銨鹽析、透析、超濾離心和Sephadex G-100凝膠過濾層析進行分離純化。結果表明，其最佳發酵培養基為0.5%的肌酐作為碳源、0.3%胰蛋白胨和0.2%玉米漿作為復合氮源，誘導物肌酸含量為0.3%；其最佳發酵條件為作用pH值7.5、溫度25℃、裝液量50 mL/250 mL、接種量3%。Fe2+和Mn2+能顯著促進產酶。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳結果顯示，純化后的肌酐水解酶分子質量為24.3 ku。

肌酐水解酶；培養基；發酵條件；優化；分離純化

肌酐水解酶（creatininase）EC 3.5.2.10可偶聯肌氨酸氧化酶將肌酐降解為肌酸、甲醛和過氧化氫[1]。作為一種重要的診斷酶制劑，肌酐水解酶被應用于臨床檢測血清中的肌酐含量[2-3]，用來診斷腎臟功能的健康程度。

肌酐含量檢測已成為臨床常規的檢測項目，但國內因原酶提取技術不成熟、臨床需酶量大、誘導物價格昂貴等因素使得酶促檢測法的推廣受到延滯[4-5]，普遍采用的化學檢測法因其特異性差、易受樣品干擾而使得檢測結果不準確[6]。肌酐水解酶作為酶促反應中的第一步[7]，其酶的純度及酶學性質因來源不同而有一定差異，會直接影響作用效果，如分子質量、亞基組成和蛋白質組成等[8-10]，因此研究其純度及性質變得尤為重要。此外，肌酐作為腎臟功能性障礙及尿毒癥患者血液中僅次于尿素氮的第二大毒素[11]，其含量的累積對紅細胞有一定的損害[12]。而我國關于清除肌酐的藥物研究涉及較少，因此研究開發肌酐水解酶的特性并應用于醫療事業是研究者當前面臨的重要問題和挑戰。

本實驗利用海洋資源篩選出一株產肌酐水解酶的微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09，通過單因素實驗優化S-09產酶條件，粗酶液經鹽析、透析及Sephadex G-100凝膠柱層析進行分離純化。目的是增加菌種來源、提高原酶純度，為探究清除肌酐藥物研制及進一步開發國產診斷酶制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09：分離自渤海海域（123°371′E，39°6972′N）海泥樣品中，現由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

1.1.2 培養基

固體活化培養基采用LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：肌酐0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

肌酐（分析純）：大連凱美化工工程配套有限公司；肌酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；苦味酸（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HZP-250全溫振蕩培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：日本三洋電機株式會社；LTI-700恒溫培養箱：上海愛朗儀器有限公司；HD-1360超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；GelDoc XR+凝膠成像系統：廣州市龍煜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

無菌條件下，將保存于4℃條件下的斜面菌株接種到固體活化培養基中，25℃培養24h，純化2次以備后續實驗使用。

1.3.2 種子培養

無菌條件下挑取斜面上菌體一環，于裝液量為100 mL/ 250mL的種子培養基中，于25℃、180 r/min搖床培養24 h。

1.3.3 發酵培養

按接種量1%吸取一定的種子液于裝液量為200 mL/ 500mL的發酵培養基中，于25℃、180r/min搖床培養36h。

1.3.4 肌酐水解酶活測定方法[13-14]

取0.1 mL的酶液加入0.9 mL肌酸溶液中，37℃反應10 min后取出0.1 mL反應液加入1 mol/L NaOH和0.5%苦味酸（各1 mL）終止反應，加入0.9 mL蒸餾水，于25℃水浴鍋水浴20 min后于波長520 nm處測吸光度值。肌酐水解酶活力定義：在上述反應條件下，每分鐘催化1 μmol肌酐轉變成產物所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.5 發酵條件單因素優化

通過對菌株生長的發酵培養基和發酵條件的優化，最終獲得最適合菌株生長及其發酵條件，在原來的基礎上提高發酵產物的產量，以期達到生產最大發酵產物的目的，是微生物產業化中重要的一步[15]。本實驗以菌株S-09為出發菌株，探究發酵培養基配比和發酵的最優條件。

（1）最適誘導物濃度對菌株S-09發酵產酶的影響

選取肌酸為誘導物，探究不同加入量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%）對酶活的影響。種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（2）不同碳源對菌株S-09發酵產酶的影響

分別選用0.5%不同碳源（肌酐、可溶性淀粉、花生油、乳糖、蔗糖、檸檬酸鈉）作為唯一碳源，種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（3）不同氮源對菌株S-09發酵產酶的影響

分別選用0.5%不同氮源（胰蛋白胨、酵母膏、魚粉蛋白胨、牛肉膏、玉米漿）作為唯一氮源，種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（4）復合氮源配比對菌株S-09發酵產酶的影響

在選取最適氮源的基礎上以（胰蛋白胨+玉米漿）為復合氮源，胰蛋白胨與玉米漿配比分別為0.2%∶0.2%、0.2%∶0.3%、0.2%∶0.4%、0.3%∶0.2%、0.3%∶0.3%、0.3%∶0.4%，探究不同復合氮源配比對菌株產酶性能的影響。種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（5）pH對菌株S-09發酵產酶的影響

分別設置培養基初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（6）培養溫度對菌株S-09發酵產酶的影響

設置培養溫度為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃及不同培養時間的菌體（18 h、30 h、42 h），種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（7）裝液量對菌株S-09發酵產酶的影響

設置裝液量分別為25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/ 250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL的發酵培養基，種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（8）接種量對菌株S-09發酵產酶的影響

種子培養基分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

（9）金屬離子對菌株S-09發酵產酶的影響

向培養基中加入濃度為0.5mmol/L的不同種類的金屬離子（FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CuCl2、CoCl2、MgCl2），種子培養基以5%的接種量接種到發酵培養基后，于25℃、180 r/min振蕩培養36 h后破碎離心取上清測定酶活，相對酶活計算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實驗。

1.3.6 酶的分離純化

（1）粗酶液的制備

將純化后的菌株S-09接于發酵培養基中，培養36 h。發酵菌液于4℃、4 000 r/min離心30 min得到菌體，用超純水將菌體水洗2次，4℃、4 000 r/min離心30 min。將離心得到的濕菌體用0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.5）溶解。冰浴條件下用超聲波細胞粉碎機裂菌（作用3 s，間隔3 s，120 W，共10 min）。在低溫（4℃）條件下10 000 r/min離心10 min收集上清液即為肌酐水解酶粗酶液。

（2）硫酸銨沉淀

制備6份粗酶液，參照硫酸銨鹽析溶解度表，向酶液中加入硫酸銨固體使其硫酸銨飽和度分別達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。低溫（4℃）保存12 h，離心收集沉淀用磷酸緩沖液溶解，分別測定不同梯度的沉淀蛋白濃度和酶活力，繪制鹽析標準曲線。

（3）透析和超濾

將鹽析得到的樣品裝入預先處理好的透析袋（截留分子質量14 000 u）中，4℃條件下透析，期間更換透析液。而后加入氯化鋇溶液，直到無白色沉淀生成為止，檢測透析液中無SO42-；將完成透析的樣品轉移到超濾管中進行蛋白濃縮，4℃、4 000 r/min離心10 min，測定肌酐水解酶酶活。

（4）SephadexG-100凝膠過濾層析

正確連接凝膠柱、核算蛋白檢測儀、自動收集器和顯示器，控制蛋白檢測儀T值為100。待基線平衡后將超濾后的濃縮酶液2 mL加入用同樣緩沖液平衡好的Sephadex G100凝膠柱（Ф1.6 cm×60 cm）中。調節設置自動收集器，根據顯示器上的洗脫峰，記錄相應試管管號，測定肌酐水解酶酶活力。

1.3.7 肌酐水解酶分子質量的測定

采用濃度為12%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），考馬斯亮藍R-250染色1 h后脫色至無色，根據分子質量和相對遷移率的關系確定肌酐水解酶分子質量。

2 結果與分析

2.1 單因素優化結果

2.1.1 肌酸含量對菌株S-09發酵產酶的影響

肌酐水解酶是一種誘導酶，而誘導物的昂貴價格是發酵產酶商業生產中的一大障礙[16]，因此研究肌酸的有效加入量具有重要意義。不同肌酸含量對肌酐水解酶相對酶活的影響結果見圖1。由圖1可知，肌酸作為誘導物加入培養基中使得酶活有所提高，當培養基中不添加肌酸時酶活較低，隨著肌酸含量的增加酶活呈不斷上升趨勢，當肌酸加入量在0.3%～0.8%時，相對酶活不斷增大并在肌酸加入量為0.8%時達到100%；肌酸含量＞0.8%時，肌酐水解酶相對酶活出現下降趨勢。最終選取0.3%為最適肌酸加入量，原因是誘導物價格昂貴，加入少量誘導物不僅能提高酶的產量，而且更好的降低成本提升經濟效益。

圖1 肌酸含量對酶活的影響Fig.1 Effect of creatine contents on enzyme activity

2.1.2 不同碳源對菌株S-09發酵產酶的影響

不同碳源對菌株S-09發酵產酶的影響結果見圖2。由圖2可知，乳糖和葡萄糖作為碳源時酶活較低，而可溶性淀粉和檸檬酸鈉作為碳源時酶活相對較高，肌酐作為碳源時相對酶活達到100%，并且肌酐還是一種誘導物能促進產酶。因此，選取肌酐作為最適碳源。

圖2 碳源種類對酶活的影響Fig.2 Effect of carbon source types on enzyme activity

2.1.3 不同氮源對菌株S-09發酵產酶的影響

不同氮源對菌株S-09發酵產酶的影響結果見圖3。由圖3可知，以魚粉作為氮源時相對酶活最低，酵母膏和牛肉膏作為氮源時能促進產酶但酶活水平一般，以胰蛋白胨和玉米漿作為氮源時不僅能穩定的促進產酶而且相對酶活達到100%。因此，選擇胰蛋白胨和玉米漿作為培養基最適氮源。

圖3 氮源種類對酶活的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on enzyme activity

2.1.4 復合氮源配比對菌株S-09發酵產酶的影響

胰蛋白胨和玉米漿都能較好的促進產酶，但兩者含有不同種類的氨基酸、維生素及生長因子[17]。因此在選取（胰蛋白胨+玉米漿）為復合氮源，探究胰蛋白胨與玉米漿配比對酶活的影響，結果見圖4。由圖4可知，胰蛋白胨與玉米漿配比為0.2%∶0.4%和0.3%∶0.4%時氮源濃度較高，但其產酶活性并非最高，分析可能濃度過高對菌體生長產生一定抑制。而胰蛋白胨與玉米漿配比為0.3%∶0.2%時，添加到培養基中能更好的促進產酶，肌酐水解酶相對酶活達到100%。因此，胰蛋白胨與玉米漿最佳配比為0.3%∶0.2%。

圖4 胰蛋白胨與玉米漿配比對酶活的影響Fig.4 Effect of tryptone and corn steep liquor ratio on enzyme activity

2.1.5 pH對菌株S-09發酵產酶的影響

不同pH值對肌酐水解酶酶活的影響結果見圖5。由圖5可知，pH在6.5～7.5范圍內相對酶活隨pH值的增加而增大；在pH 7.5時肌酐水解酶相對酶活達到100%；在pH＞8.0時相對酶活隨pH值的增加而降低。因此，發酵最適pH值為7.5。

圖5pH對酶活的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

2.1.6 培養溫度對菌株S-09發酵產酶的影響

由圖6可知，生長時間為18 h的菌體產酶量增長緩慢，生長時間為30 h的菌體在25℃培養溫度下菌體產酶達到最大值，相對酶活為100%，生長時間為42 h的菌體產酶量呈下降趨勢，分析原因可能是隨著培養基中營養物質逐漸消耗，菌體產酶能力開始下降。因此，最佳培養溫度為25℃。

圖6 培養溫度對酶活的影響Fig.6 Effect of culture temperature on enzyme activity

2.1.7 裝液量對菌株S-09發酵產酶的影響

由圖7可知，裝液量對菌體產酶酶活的影響并不是很大，裝液量在50 mL/250 mL時肌酐水解酶相對酶活達到100%，此時溶氧量適宜菌體生長，隨著裝液增多相對酶活有所下降，分析原因可能是通氣不足溶氧量較少影響菌體產酶能力。因此，選取50 mL/250 mL為最適裝液量。

圖7 裝液量對酶活的影響Fig.7 Effect of liquid volume on enzyme activity

2.1.8 接種量對菌株S-09發酵產酶的影響

由圖8可知，當接種量為1%～2%時，相對酶活較低。當接種量變大時酶活反而呈下降趨勢，說明此時由于營養成分的逐漸消耗和溶氧不足等因素的影響，接種過量不利于發酵產酶。當接種量為3%時，相對酶活為99%；當接種量為5%時，肌酐水解酶相對酶活達到100%。但考慮到微生物的實際生產，選取3%為最適接種量，不僅起到高產量的作用還能為生產降低大量成本。

圖8 接種量對酶活的影響Fig.8 Effect of inoculum on enzyme activity

2.1.9 金屬離子對菌株S-09發酵產酶的影響

向培養基中加入濃度為0.5 mmol/L的不同種類的金屬離子（Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Mg2+），接種后培養36 h取樣測定酶活力，結果見圖9。由圖9可知，Zn2+、Cu2+對酶有一定的抑制作用，與NISIHYA Y等[18]研究表明的肌酐水解酶是一種含有Zn2+的金屬酶有所不同。Co2+、Mg2+對酶活影響不大，Fe2+、Mn2+對菌株發酵產酶有顯著的促進作用。

圖9 金屬離子對酶活的影響Fig.9 Effect of metal ions on enzyme activity

2.2 酶的分離純化

2.2.1 硫酸銨鹽析曲線

由圖10可知，當硫酸銨飽和度達到40%時，沉淀中開始出現肌酐水解酶活性；當硫酸銨飽和度達到60%時，沉淀中的酶活達到100%。因此，表明該酶在硫酸銨飽和度達到40%～60%飽和度之間可以被有效地沉淀分離。

圖10 硫酸銨鹽析曲線Fig.10 Salting out curve ammonium sulfate

2.2.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析

SephadexG-100凝膠過濾層析結果如圖11所示，在整個洗脫過程中出現5個蛋白吸收峰，通過測定酶活可知，肌酐水解酶主要集中在最后一個蛋白吸收峰（64～75號）內。收集最后一個蛋白吸收峰內的酶液，濃縮后進行下一步電泳。

圖11Sephadex G-100凝膠過濾層析結果

Fig.11 Gel filtration chromatogram results of Sephadex G-100

2.2.3 肌酐水解酶分子質量的測定結果

圖12SDS-PAGE電泳圖Fig.12 Electrophoretogram of SDS-PAGE

分別取粗酶液、鹽析酶液和純化后的肌酐水解酶樣品進行SDS-PAGE電泳。結果見圖12。由圖12可知，SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化后的肌酐水解酶為單一條帶。根據分子質量和相對遷移率的關系，得出分子質量約為24.3 ku，與TSURU D等[19]研究報道的肌酐水解酶分子質量在23～33.7 ku之間相符。

3 結論

本實驗選擇的微小桿菌S-09為革蘭氏陽性菌，且原始酶活較高，并對其發酵培養基和發酵條件進行單因素優化，以及對肌酐水解酶進行了分離純化，結果表明，肌酐0.50%、胰蛋白胨和玉米漿配比為0.3%∶0.2%、肌酸含量0.3%、最適作用pH 7.5、最適溫度25℃、通氣量50 mL/250 mL、接種量3%、Fe2+和Mn2+能顯著促進產酶，SDS-PAGE結果顯示，肌酐水解酶的分子質量為24.3 ku。通過研究影響產酶因素、確定最優產酶條件、對酶進行分離純化，為酶法生產國產試劑盒并實現商品化奠定了基礎。

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Optimization of fermentation conditions of creatininase-productingExiguobacteriumsp.S-09 and separation and purification of creatininase

SHI Qun1,2,ZHANG Qingfang1,2,YANG Lina1,2,REN Nannan1,2,QIAO Hui1,2,CHI Naiyu1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center,Dalian 116622,China)

UsingExiguobacteriumsp.S-09 from marine as original strain,the fermentation medium and creatininase-producing condition were optimized.The crude enzyme was separated and purified by salting out,dialysis,ultrafiltration and Sephadex G-100 gel filtration chromatography.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:creatinine 0.5%,tryptone 0.3%,corn steep liquor 0.2%,creatine 0.3%,initial pH 7.5,culture temperature 25℃,liquid volume 100 ml/250 ml,inoculum 3%.Fe2+and Mn2+can strongly activate enzyme production.SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular mass of creatininase purified was about 24.3 ku.

creatininase;medium;fermentation conditions;optimization;separation and purification

Q93

0254-5071（2017）04-0020-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.005

2017-02-08

國家高技術研究發展計劃‘863計劃’（2007AA021306）

石群（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物與酶工程。

*通訊作者：遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向為微生物與酶工程。