透明質酸接枝普魯蘭糖的制備與表征

楊文智，王樹根，劉嬌艷，賈蓓，李海鷹

(河北大學 藥學院，河北 保定 071002)

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透明質酸接枝普魯蘭糖的制備與表征

楊文智，王樹根，劉嬌艷，賈蓓，李海鷹

(河北大學 藥學院，河北 保定 071002)

采用化學交聯法，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)為脫水劑、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)為催化劑，將透明質酸(Hyaluronicacid，HA)接枝到普魯蘭(Pullulan，Pu)糖長鏈上，制備透明質酸-普魯蘭糖(HA-Pu)新型材料．傅里葉變換紅外和氫核磁表征顯示，成功合成HA-Pu材料，并用1HNMR法確定HA-Pu的透明質酸取代度．合成新材料凍干后可壓制獲得HA-Pu膜，掃描電鏡下觀察，HA-Pu膜為層狀結構，具備很多微小孔洞．體外酶降解實驗表明，新型HA-Pu膜較透明質酸具有更好的抵抗酶降解性能．HA-Pu新材料合成有望拓展透明質酸在醫藥領域的應用．

透明質酸；普魯蘭糖；化學接枝；體外酶降解

透明質酸(hyaluronic acid，HA)俗名玻尿酸，是一種線性陰離子多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復單元組成，1934年首次從牛眼中分離獲得．HA廣泛分布于動物和人體結締組織細胞外基質中，在眼玻璃體、皮膚、軟骨和滑液中含量較高．HA具備良好的生物相容性，廣泛用于醫藥與化妝品行業[1-2]．普魯蘭多糖(pullulan，Pu)是出芽短梗霉菌分泌的次級代謝產物，由3個葡萄糖單元通過α-(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵連接而成[3]．Pu具備良好生物安全性而廣泛應用于食品及醫藥行業．近年，為了擴展天然普魯蘭多糖在醫藥領域的應用，化學修飾普魯蘭糖成為熱點研究領域[4,5]．為解決HA易被體內酶分解導致體內存留時間短的問題[6,7]，專利[8]采用1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)為交聯劑，化學接枝透明質酸與普魯蘭糖，制備其用于皮下注射的顆粒劑，可延緩體內降解時間．但BDDE交聯劑有毒，痕量殘留會導致機體毒性反應，故嚴控產品BDDE殘留量尤為重要[9]．本研究針對BDDE交聯劑有毒的突出問題，嘗試催化透明質酸與普魯蘭糖自身交聯反應，避免引入第3種化學交聯劑，對HA進行化學改性，希望制備具備較好生物安全性的HA-Pu接枝材料以減緩其在體內的降解速度．

1 實驗部分

1.1 儀器

FA2104N型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本，島津儀器有限公司)；AVANCEⅢ型600MHz核磁共振波普儀(美國，Bruker儀器公司)；UV-8500型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；TM3000型掃描電鏡儀(日本，日立儀器有限公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，250W)；THZ-82型氣浴恒溫振蕩箱(金壇市醫療儀器廠)；HJ-6型磁力加熱攪拌器(金壇市城東鑫瑞儀器廠)．

1.2 試劑

透明質酸(5 400u，山東福瑞達醫藥有限公司)；普魯蘭多糖(10ku，鄭州明鑫化工有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、4-二甲基氨基吡啶(國藥集團上海試劑有限公司)；葡萄糖醛酸標準品、透明質酸酶(300U/mg，Sigma)；其他試劑均為分析純(天津科密歐化學試劑有限公司)．

1.3 新型HA-Pu材料的制備

按照圖1所示合成路線，稱取EDC(200mg，0.001mmol)、DMAP(150mg，0.0015mmol)，分別投料按HA(100mg，0.002mmol)、普魯蘭糖(100mg，0.001mmol)以及HA(400mg，0.008mmol)、普魯蘭糖(100mg，0.001mmol)制備材料HA-Pu-Ⅰ、HA-Pu-Ⅱ．首先將HA溶于25mL二甲基亞砜中， 1mol/L鹽酸調pH至3.5～4.0，將EDC和DMAP依次加入到透明質酸液中，室溫磁力攪拌2h．將普魯蘭多糖溶于適量的二甲基亞砜中，將其溶液緩慢滴加至已活化的透明質酸液中，50 ℃磁力攪拌48h，將反應液轉移至透析袋(8 000～14 000u)去離子水中透析48h，透析液冷凍干燥，得到海綿狀樣品．

圖1 HA-Pu接枝材料合成路線Fig.1 Synthetic route of Hyaluronic acid grafted pullulan

1.4 樣品紅外光譜分析

將待測樣品放在紅外燈下照射烘干，取適量樣品與KBr充分研磨至細粉末狀，壓片后采用FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀檢測，掃描波數400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1．

1.5 樣品1H NMR波譜檢測

測定HA、Pu以及HA-Pu氫核磁波譜，取樣品20 mg溶于0.5 mL D2O中，以四甲基硅烷為內標，置于AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振儀中，測定樣品的氫核磁圖譜．采用1H NMR法測定透明質酸接枝取代度，計算每個葡萄糖殘基上偶聯透明質酸個數．

1.6 HA-Pu材料體外酶降解實驗

1.6.1 葡萄糖醛酸標準曲線的建立

精密稱取葡萄糖醛酸標準品，配成40 μg/mL儲備液，分別量取儲備液0，1.25，2.50，5.00和7.50 mL加至10 mL容量瓶中，加水定容，移取上述溶液1 mL加至25 mL具塞試管中，冰浴中冷卻，緩慢滴加0.025 mol/L硫酸硼砂液5.0 mL，加塞密閉，沸水浴加熱10 min后冷卻，移取質量分數0.125%咔唑試劑0.2 mL，搖勻，沸水浴15 min后冷卻至室溫．采用紫外-可見光光度法，于530 nm處測定吸光度[7]．以吸光度A對藥物質量濃度ρ(μg/mL)作圖，得到葡萄糖醛酸標準曲線為A=1.34×10-2ρ+9.44×10-2(R2=0.998 4；n=5)，線性范圍為5～40 μg/mL．

0.025mol/L的硫酸硼砂溶液：稱取四硼酸鈉4.77g，溶于濃硫酸500mL中即得．

質量分數0.125%的咔唑試劑：稱取咔唑0.125g，溶于100mL無水乙醇，即得．

1.6.2HA和HA-Pu新型材料的體外酶降解實驗

分別剪取尺寸為0.5cm×0.5cm,質量約為7mgHA和HA-Pu(Ⅰ～Ⅱ)樣品至10mLEP管中，加入2mL100U/mL新鮮透明質酸酶溶液，樣品置于37 ℃ 150r/min恒溫氣浴搖床中，在設定時間從EP管中移取200μL樣品，立即補充同體積的新鮮酶液．200μL樣品液稀釋50倍，取1mL置于25mL具塞試管，冰浴冷卻，振搖下緩慢滴加0.025mol/L硫酸硼砂液5.0mL，加塞密閉，按照1.6.1項下操作，測定樣品吸光度，計算累積釋放量[7]．

2 結果與討論

2.1 紅外圖譜分析

樣品紅外圖譜見圖2，由于普魯蘭多糖、透明質酸、物理混合物樣品和透明質酸接枝普魯蘭糖分子中存在大量游離-OH與-CH2-，故3 200～3 600 cm-1顯示出強的-OH的伸縮振動峰和2 925 cm-1較強C—H伸縮振動峰[10]；由于透明質酸、物理混合物樣品、接枝普魯蘭糖樣品中存在-NHCOCH3取代基團，故1 655 cm-1處出現較強的酰胺帶吸收峰，而普魯蘭多糖分子中沒有-NHCOCH3基團，在此波數處未見強吸收[11]．透明質酸接枝普魯蘭糖樣品與物理混合物樣品相比，在1 720 cm-1處出現酯羰基伸縮振動吸收峰[12]，此重要特征峰出現，證明透明質酸接枝普魯蘭糖樣品非簡單的普魯蘭糖與透明質酸的物理混合，而是透明質酸的羧基與普魯蘭糖的羥基經酯化反應接枝到多糖分子長鏈上．

a.透明質酸；b.普魯蘭糖；c.透明質酸普魯蘭糖混合物；d.透明質酸-普魯蘭材料.圖2 紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra for the simple

2．21H NMR 譜圖分析

樣品1H NMR譜圖見圖3，透明質酸和透明質酸接枝普魯蘭糖樣品中存在-NHCOCH3基團，故在1.8～2.0出現較強的-CH3峰；透明質酸在4.36和4.45分別出現dd峰，分屬透明質酸中葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖單元H-1質子峰[13]，而透明質酸接枝普魯蘭糖對應透明質酸H-1質子峰出現在4.35和4.44，由于接枝后H-1化學環境發生變化，導致透明質酸H-1質子峰化學位移遷移0.01．而酯化反應對普魯蘭糖H-1影響較小，故普魯蘭糖與透明質酸接枝普魯蘭糖樣品中普魯蘭糖分子鏈α-(1-4)糖苷鍵連接的H-1位dd峰出現在5.25～5.29[14]．由于反應過程采用酸化步驟，此過程可催化乙酰氨基水解，脫除乙酰基而游離部分氨基，故透明質酸接枝普魯蘭糖樣品圖譜在2.7～2.8出現糖單元游離氨基后的H-2吸收峰．

a.透明質酸；b.普魯蘭糖；c.透明質酸-普魯蘭糖材料.圖3 核磁波譜圖Fig.3 Spectra of 1H NMR

按照公式以特征峰峰面積比值計算取代度[15](見表 2)

公式中，DS代表HA-Pu材料中透明質酸的取代度；I4.34和I4.45分別代表透明質酸中葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖單元H-1對應氫核磁峰面積；I5.25 ～ 5.29代表普魯蘭糖分子α-(1-4)糖苷鍵連接的H-1對應氫核磁峰面積．

表2 HA-Pu材料中透明質酸取代度

2.3 掃描電鏡顯微觀察

取膜樣品于掃描電鏡下觀察，由圖4可知，天然透明質酸膜表面呈層狀疊放且分布較大孔洞；普魯蘭多糖膜呈致密層疊狀，表面平整光滑，少見孔洞；透明質酸-普魯蘭糖膜表面呈疏松層狀疊放，具有10～20 μm較小孔洞．膜結構差異，一方面可改變材料的吸水率，作為傷口膜敷料可吸收更多組織滲液，利于創面修復；此外，疏松多孔層狀疊放的HA-Pu膜材料，可獲得柔軟膜材料，利于與傷口緊密貼合，膜材料的多孔結構利于傷口與外界空氣接觸，可有效促進傷口愈合．

a.透明質酸;b.普魯蘭糖;c.透明質酸-普魯蘭糖材料.圖4 掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of sumple

2.4 體外酶降解實驗

合成的HA-Pu材料酶降解實驗結果見圖5，合成的HA-Pu-Ⅰ與HA-Pu-Ⅱ材料相比透明質酸，顯示出較好的抵抗透明質酸酶降解特性．制備的2種HA-Pu材料和透明質酸降解速度明顯不同，考慮到5 400 u的透明質酸屬長鏈有機高分子，此時的透明質酸酶可以充分接觸到透明質酸分子鏈，有效降解透明質酸．HA-Pu材料上殘存短鏈透明質酸分子段，由于接枝，殘留透明質酸分子段可被普魯蘭糖分子長鏈纏繞或包裹，增大透明質酸酶與殘留透明質酸分子段接觸的難度，減緩殘留透明質酸分子的酶降解，故透明質酸3d接近完全降解，而HA-Pu-Ⅰ和HA-Pu-Ⅱ材料分別降解約20%和30%，HA-Pu-Ⅰ和HA-Pu-Ⅱ材料完全降解時間分別延長到12 d和14 d．研究結果顯示：隨著HA-Pu材料中透明質酸取代度增大，制備獲得的HA-Pu材料對抗酶降解能力增強，HA-Pu新材料較純透明質酸抵抗透明質酸酶降解能力顯著．

圖5 體外酶降解釋放圖(n=5，P<0.02)Fig.5 Enzyme degradation in vitro(n=5,P<0.02)

3 結論

本文采用酯化反應將透明質酸接枝到普魯蘭糖長鏈上，其合成方法簡便易行．獲得HA-Pu樣品經紅外和1H NMR表征證明，此合成方法可成功制備HA-Pu新材料．HA-Pu膜材料酶降解實驗表明，合成2種不同透明質酸取代度的HA-Pu膜材料較透明質酸相比，具備較優的對抗透明質酸酶降解作用且隨透明質酸取代度增大其抗降解能力相應提高．HA-Pu膜的掃描電鏡圖顯示，材料表面疏松多孔，利于組織細胞增殖有望促進皮膚傷口愈合．

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(責任編輯：梁俊紅)

Preparation and characterization of a new hyaluronic acid grafted pullulan material

YANG Wenzhi,WANG Shugen,LIU Jiaoyan,JIA Bei,LI Haiying

(College of Pharmacy,Hebei University,Baoding 071002,China)

A series of hyaluronic acid grafted pullulan(HA-Pu)were prepared by esterification reaction,using 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide(EDC)as dehydrating agent and 4-dimethylaminopyridine(DMAP)as catalyst.The structure of HA-Pu was confirmed by the Fourier transform infrared spectrum(FTIR)and proton nuclear magnetic resonance(1H NMR),and the degree of substitution(DS) of hyaluronic acid moiety was determined by1H NMR.The freeze-dried HA-Pu materials could be compressed to obtain a HA-Pu film.The HA-Pu film was observed by scanning electron microscopy(SEM),which obtained the layered microstructure with a lot of small holes.Compared with hyaluronic acid,the HA-Pu materials have better ability to resist enzyme degradationinvitro.Therefore,HA-Pu should be a promising novel material to expand the application of hyaluronic acid in pharmaceatics.

hyaluronic acid；pullulan；chemical grafting；enzyme degradation in vitro

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.006

2016-08-10

河北省高等學校科學技術研究項目(ZD2016102)；河北大學研究生創新項目(X2016071)

楊文智(1972—)，男，內蒙古錫林浩特人，河北大學副教授，從事生物醫用材料及藥物緩控釋制劑方面研究．E-mail:wenzhi_yang@sina.com

O

A

1000-1565(2017)02-0141-06