利用RNAi技術控制害蟲

閘雯俊+李三和+周雷+劉凱+陳志軍，楊國才，劉++凱+徐華山+李培德+游艾青

摘要：RNAi能夠抑制基因特異序列的表達，為昆蟲學的研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害蟲種群以及減少疾病病原體的感染。昆蟲RNAi的相關文獻發現不同的種群、RNAi的攝入方式、靶標基因都會影響RNAi的效率，這也是轉錄本抑制程度存在差異的原因所在。對于那些不能穩定轉基因的物種，如昆蟲，利用dsRNA介導的RNAi技術是快速分析基因功能的重要手段。

關鍵詞：RNAi；害蟲控制；dsRNA

中圖分類號：S476.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1006-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.002

Abstract： RNA interference（RNAi）， the sequence-specific suppression of gene expression， offers great opportunities for insect science， especially to analyze gene function， manage pest populations， and reduce disease pathogens. The accumulating body of literature on insect RNAi has revealed that the efficiency of RNAi varies between different species， the mode of RNAi delivery， and the genes being targeted. There is also variation in the duration of transcript suppression. Double-stranded RNA（dsRNA） mediated RNAi has emerged as one of the most powerful strategies for the rapid analysis of gene function，particularly in organisms for which stable transgenesis is not available，such as insects.

Key words： RNAi； insect pest control； dsRNA

RNA干擾（RNA interference，RNAi）已經徹底改變了昆蟲學研究的范圍，因為它使研究者能夠抑制目的基因的表達，從而將改變的表型和基因功能聯系起來。對于基礎研究而言，RNAi為所有的昆蟲基因組學研究提供了一條路徑，同時對應用昆蟲學也有巨大的潛在作用。例如，RNAi能夠通過抑制關鍵基因提高死亡率來控制害蟲。此外，利用無害的病毒序列來啟動抗病毒RNAi反應，能夠有效防止益蟲（如蜜蜂和家蠶）感染高致病性病毒。

1 RNAi的機制

RNAi是利用非編碼的小RNA分子切割靶標mRNA來抑制基因的表達。主要分為以下3個階段。

1）起始階段。核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以ATP依賴的方式，逐步切割加工導入生物體的外源或內源性轉錄生成的dsRNA，生成21～23 nt的siRNA（small interfering RNA），其與靶標mRNA具有高度特異性，為成功降解提供保證。

2）效應階段。siRNA雙鏈結合其他蛋白復合物形成RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex RISC），雙鏈siRNA解鏈，RISC介導單鏈反義siRNA通過堿基配對原則從siRNA引導鏈中心所對應的靶基因位置切割靶mRNA，進一步降解mRNA，同時還可以引發宿主細胞的一系列反應。

3）放大效應階段。siRNA在引導RISC切割靶RNA的同時，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA為模板合成新的dsRNA。緊接著進入第一階段循環過程生成大量次級的siRNA，經過逐級放大效應，使mRNA徹底降解。

2 利用RNAi控制害蟲群體

利用RNAi技術控制害蟲和保護馴化的益蟲（例如蜜蜂）已經得到廣泛應用。一般情況下，RNAi序列適用于任何形式，從單個基因型到家系甚至昆蟲所屬的目。

2.1 利用RNAi控制害蟲

利用RNAi控制害蟲最早應用于玉米根蟲[1]和棉鈴蟲[2]。研究者喂養玉米根蟲含有290條dsRNAs的人工飼料，其中發現14個基因會使成蟲的生理活動下降，并且對液泡ATP酶亞基A基因（V-ATPase）進行了詳細的分析。人工飼料中只含有低濃度的V-ATPase的dsRNAs，經玉米根蟲取食后，相應的mRNA也會受到抑制。更重要的是，研究者將玉米根蟲喂養在表達V-ATPase dsRNAs的轉基因玉米上后，發現根蟲的V-ATPase基因表達量下降，玉米根部受損程度降低。研究者發現棉鈴蟲有一個靶標基因細胞色素P450（CYP6AE1），該基因在幼蟲中腸中表達，對棉花的二級次生代謝產物棉子酚具有解毒功能。當將棉鈴蟲喂養在表達CYP6AE14-dsRNA的轉基因擬南芥和煙草上時，該基因在蟲體中腸里的表達量下降，幼蟲生長發育減速[3]。同時玉米根蟲和棉鈴蟲也都有了新的研究發現。其中Snf7基因主要參與膜受體的運輸，在玉米根蟲中的效果非常顯著[4]。同時在棉花中表達半胱氨酸蛋白酶后，棉鈴蟲取食轉基因植株后，蟲體圍食膜的功能減弱，變得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同時表達dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比單一表達其中一個基因的抗性要強[5]。

上述研究闡明了利用RNAi控制害蟲有兩個關鍵因素：①用于RNAi靶標基因序列的選擇。②傳遞dsRNA的方式。其中靶標基因必須是昆蟲的關鍵基因，同時在昆蟲的整個生活史中要持續表達。隨著技術從理論證明到應用的轉變，嚴苛設計靶標序列是必須的。先決條件就是從dsRNA中獲得的21～25 bp siRNAs必須與序列保證完全的一致性，同時還要與昆蟲的mRNA具有同源性。并且還要與非靶標物種的所有siRNAs和編碼蛋白基因具有序列差異性。這些比對都可以在網上進行，將候選的dsRNA同時與靶標物種的目的基因及所有公共基因組中預測的編碼蛋白的基因進行比對。要杜絕不能與靶標序列完全匹配的siRNAs以及與非靶標物種序列匹配的siRNAs。