小硅藻光合作用脂13KG—4C穩定同位素定量標記分析

宗春光 李雙 徐繼林 李艷榮 鐘鶯鶯 俞雪鈞 周成旭 嚴小軍

摘要 以小硅藻（Nitzschiaclosteriumf.minutissima）作為研究對象，利用超高壓液相色譜聯用四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜技術，研究了處于平臺期的小硅藻中的光合作用脂被13C標記的程度和速度。結果顯示：在平臺期13C人工標記的10天內，所有4類光合作用脂均被13C明顯標記，其中二酰甘油雙半乳糖脂（DGDG）、磷脂酰甘油（PG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）被13C標記的總量，從剛進入平臺期到平臺期第8天逐漸增加，此后出現下降趨勢，在第8天分別達到最大值（173±24）ng/mg，（473±41）ng/mg及（1224±21）ng/mg，標記率分別達到56.3%，38.4%和62.6%；而二酰甘油單半乳糖脂（MGDG）被13C標記的總量在整個平臺期呈現持續上升趨勢，并在第10天達到（956±51）ng/mg，標記率為87.3%?？梢?，不同脂質在藻體內合成的先后時間有差別，為了清晰地了解生物攝食過程中對微藻中特定脂類的同化機理，需要藻體內被13C標記的每類脂質含量的最大化，針對DGDG、PG、SQDG，應選取標記了8天的微藻來投喂生物，而針對MGDG，則應選取標記了10天的微藻投喂生物。

關鍵詞小硅藻；13C穩定同位素；靜電場軌道阱高分辨質譜；定量標記

1引言

微藻作為海洋生態系統的初級生產者，在海洋生物圈的能量流動和物質循環中發揮著極其重要的作用[1＼]。有些微藻營養豐富，富含多種不飽和脂肪酸如EPA、DHA等[2，3＼]，許多研究表明微藻是許多養殖生物特別是養殖貝類的優質餌料[4＼]。而微藻對養殖貝類的營養價值跟蛋白質、碳水化合物關系不大，主要體現在其脂類組成上[5＼]。與其它生物脂比較，微藻葉綠體的類囊體膜上有獨特的脂類成分，其主要是單半乳糖甘油二酯（MGDG），雙半乳糖甘油二酯（DGDG），硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）和磷脂（PG），這些統稱為光合作用脂[6＼]。研究表明，不同微藻脂類組成不同，從而對養殖生物可能表現出不同的營養價值[7＼]。已有許多有關生物對微藻脂類的同化效果的研究報道[4，8＼]，但這些研究大多是針對微藻中脂肪酸、甾醇組成，有關生物對微藻中光合作用脂同化的研究報道還很少見。

對代謝途徑研究，同位素示蹤被認為是最明晰的技術手段。早在上世紀70年代，就有學者利用14C放射性同位素示蹤研究脂類物質在海洋橈足類中的代謝[9＼]。而與放射性同位素相比，13C穩定同位素標記技術靈敏穩定，可用于長時間的示蹤實驗，又由于沒有放射性同位素14C輻射的損傷，不會對所觀測的過程帶來擾動，近年來，該技術已經廣泛應用于揭示物質在食物網中的循環路徑和探究消費者之間的營養關系研究[10～12＼]，但這些研究大多是通過同位素比例質譜檢測生物體內標記物同位素總量的變化，無法對特定脂類的同位素標記物進行跟蹤監測。高分辨液相色譜質譜聯用技術則可以通過多級質譜手段分析每一類脂上的同位素標記特性，近年來研究表明，穩定同位素示蹤結合高分辨液質技術可以跟蹤生物體內相關脂類合成代謝的變化，比如Li等[13]在含有被13C標記棕櫚酸的細胞培養液中培養動物細胞，通過靜電場軌道阱高分辨質譜（OrbitrapMS）技術探討了動物細胞內磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）等脂質分子之間的轉化規律，而Elizabeth等在缺氮條件下用無機13C對微藻脂類標記，通過高分辨質譜技術發現藻體內約60%的三酰甘油（TAG）是從頭合成的而非藻體內其它成分轉化而來，且磷脂酰膽堿（PC）的極性頭部來自甜菜堿脂（DGTS）的轉化[14＼]。

因此，也可通過對微藻進行13C穩定同位素標記后投喂生物的方法，跟蹤生物對不同脂類的同化以探究生物體對微藻中不同光合作用脂的代謝機理，這就需要首先考察微藻中不同脂類被13C穩定同位素標記的速度和程度。本實驗以小硅藻（Nitzschiaclosteriumf.minutissima）為研究對象，利用13C穩定同位素和超高壓液相色譜聯用四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜技術，建立了小硅藻平臺期光合作用脂被13C穩定同位素人工標記方法，為探究生物對微藻脂類生物標記物的同化及對微藻體內脂質的富集提供了明晰的技術手段。

2實驗部分

2.1儀器和試劑

UltiMate3000超高壓液相色譜分析系統，QExactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀，HypersileGoldC18色譜柱（100mm×2.1mm，1.9μm），ThermoScientificXcaliber數據分析系統（美國ThermoFisherScientific公司）；超純水系統（法國Millipore公司）。

穩定同位素內標（Glycerol213C，16KG-3∶KG-5216KG-3∶KG-50）MGDG、（Glycerol213C，16KG-3∶KG-5116KG-3∶KG-53）DGDG、（Glycerol213C，18KG-3∶KG-5018KG-3∶KG-51）PG和（Glycerol213C，16KG-3∶KG-50～18KG-3∶KG-51）SQDG（美國AvantiPolarLipids公司）；預實驗中這4個脂質分子在小硅藻中均未檢測到。甲酸（色譜純，美國SigmaAldrich公司）；NaH12CO3和NaH13CO3（13C原子數分數99%，美國Sigma公司）；儀器外標校正液（美國SigmaAldrich公司）；其它試劑均為色譜純（美國Tedia公司）。

2.2實驗方法

小硅藻種由寧波大學海洋生物實驗室藻種室提供，海水經過砂濾后經棉花粗濾，再用045μm醋酸纖維濾膜過濾后加熱煮沸滅菌，培養液采用NMB3培養液（KNO3100mg/L、KH2PO410mg/L、Fecitrate·5H2O3mg/L、VB16μg/L、VB12005μg/L）。初始接種量為6×105cell/mL，培養溫度為（20±2）℃，光照強度的范圍為3000～4000Lux，光暗周期12hKG-3∶KG-512h，每天搖動3次；采用血球計數板每天計數，在硅藻生長進入平臺期時，將藻液分裝到30個1000mL錐形瓶中，每瓶600mlL藻液，并分成2大組，每組15瓶。第一大組分成A，B，C，D，E5個小組，每組做個3平行；第二大組分成A1，B1，C1，D1，E15個小組，每組做個3平行。因空氣中含有12CO2，為了提高13C的標記效率，將每瓶分別充N230min，排凈瓶內剩余12CO2，然后，第一大組每瓶分別添加06gNaH13CO3（13C原子數分數99%，美國Sigma公司）進行13C人工標記；第二大組每瓶分別添加06gNaH12CO3作為對照組。藻液搖勻后，將所有的錐形瓶密封，為防止密封效果不佳，持續緩慢通入N2以維持瓶內低12CO2環境。每隔2天收藻1次，第1次收A和A1組，第二次收B和B1組，以此類推，連續收藻5次，將收獲的藻液在5000r/min的條件下高速離心獲取藻泥，并用超純水洗3次以去除藻體表殘留的NaH13CO3和NaH12CO3，藻樣-80℃條件下冷凍干燥后備用。然后稱取30mg藻粉，加入1KG-3∶KG-51氯仿/甲醇混合液（V/V）提取總脂，氮氣吹干，離心過濾后用甲醇復溶后對總脂進行液相色譜質譜分析。

2.3LCMS分析

色譜條件：使用UltiMate3000液相色譜儀，通過HypersileGoldC18色譜柱進行分離，柱溫45℃。流動相A為甲醇水（1KG-3∶KG-52，V/V），并添加001%LiCl作為助離子化電解質；流動相B為甲醇異丙醇溶液（1KG-3∶KG-53，V/V），并添加01%CHOOH作為助離子化電解質。洗脫梯度為：0～3min，90%～50%A；3～10min，50%～0%A；10～20min，0%A；20～201min，0%～90%A；201～25min，90%A。流速為02mL/min，進樣量為10μL，樣品進樣分析前經02μm濾膜過濾（美國Millipore公司）。

質譜條件：采用QExactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀，全掃描正/負離子模式下（質量范圍：m/z100～1300）調節分辨率為50000，自動增益控制（AGC）目標值10e6；采用加熱電噴霧電離源（ESI），噴霧電壓為3200V，離子傳輸管溫度為280℃，鞘氣壓（N2）35arb，輔助氣壓（N2）15arb，氣化室溫度350℃；串聯二級質譜選擇高能量碰撞，碰撞電壓70～90V不等。儀器使用前用外標液進行校正，在正離子模式下校正范圍為m/z138～1822，主要成分為Caffeine、MRFApeptide（MetArgPheAla）和Ultramark1621（mixture，fluorinatedphosphazines）；負離子模式下校正范圍為m/z265～1880，主要成分為Sodiumdodecylsulfate、Sodiumtaurocholate和Ultramark1621（mixture，fluorinatedphosphazines）。

2.4數據處理和定量計算方法

通過ThermoScientificXcaliber軟件進行數據分析，在正/負離子模式下，根據各種脂類在二級質譜（MS/MS）條件下的特征片段和保留時間進行定性分析。

通過計算13C標記的目標脂類與相應的內標峰面積的比值，得到半定量結果（ng/mg藻粉）。然后通過加和形式得到每類脂的總標記量，進而計算每類脂的標記率（被13C標記上脂分子的量與總量之比）。JP

3結果與討論

3.1細胞生長時期對小硅藻生物量的影響

細胞生長時期對小硅藻生物量的影響結果見圖1。由圖1可見，培養約3～9天屬于對數期，10～20天屬于平臺期，從21天開始進入衰敗期。為了確保在平臺期對細胞內的脂類進行13C標記，本實驗選取了第10天分別向實驗組和對照組中添加含有13C和12C的NaHCO3。

3.2平臺期被13C標記上的光合作用脂的定性與定量分析結果

3.2.1平臺期被13C標記上的光合作用脂的定性分析結果大量研究表明[15～17＼]，微藻在平臺期由于N和P等營養鹽缺乏，將會有更多光合固定的碳進入脂中，故選擇此時加入含有13C的無機鹽，微藻會利用培養液中的13C和從頭合成脂類，從而實現對微藻中光合作用脂的13C穩定同位素標記。對平臺期添加12C和13C兩組樣品分析發現：被13C標記上的脂類與同種利用12C合成的脂類相比，在相同的保留時間，在一級質譜上會出現一簇同位素峰[14＼]。從兩組樣品中都檢測出了所有的四類光合作用脂，即單半乳糖甘油二酯（MGDG）、雙半乳糖甘油二酯（DGDG）、硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）、磷脂酰甘油（PG）（表1），且這些脂均被13C明顯標記（圖2），陰影部分代表被13C標記的結果。另外，這4類極性脂在二級質譜譜圖中均有各自的特征片段（圖3）。

3.2.2平臺期被13C標記上光合作用脂的定量分析結果參考已建立的脂類分析方法[18～21＼]，由圖3可知，在正離子模式下，MGDG的特征離子片段為＼[C9H16O6Li＼]+其精確離子m/z227.1098，其極性頭部含有9個C，可能會有1～9C被13C標記上，出現相應的特征片段JPm/z228.1133，229.1148，2301109，231.1139，232.1268，233.1299，234.1230，235.1367和236.1401；而DGDG的特征片段＼[C15H26O11Li＼]+，且m/z=389.1628，其極性頭部有15C，可能有1～15C被13C標記，出現相應的特征片段m/z3901670，391.1701，392.1745，393.1664，394.1695，395.1732，396.1769，397.1825，398.1854，399.1884，4001941，401.1978，402.2008，403.2036和404.2119。在負離子模式下，SQDG的特征片CM（44段為＼[C6H9O7S＼] 且m/z=225.0065，極性頭部的6C，可能會有1～6C被13C標記上，出現相應的特征CM）

片段m/z226.0095，227.0126，228.0170，229.0196，2300235和231.0267；PG形成特征片段＼[C3H8O6P＼] 且m/z=171.0056，極性頭部含有3C，1～3C可能被13C標記上，出現相應的特征片段如m/z172.0089，173.0124和174.0155。另外研究發現MGDG，DGDG，SQDG和PG的生物合成途徑：都是先合成二酰甘油骨架后，在相應酶的作用下，再將整個極性頭部添加上去[22～25＼]。故可以認為在這4類極性脂中，脂肪酸鏈優先于極性頭部從頭合成。因此，可以通過極性脂的特征片段，對被13C明顯標記上的各類SQDG，PG，MGMG和DGDG進行定量分析。

在各類脂類化合物中，具有相同特征片段的物質非常多，就需要對檢測到的離子準確定性。由于儀器的分辨率高達50000，所以根據碎片離子的精確質量就可以獲得該離子可能的元素組成，再結合保留時間，就可以確定同一保留時間的離子是否為質量數相差1D的同一種物質，從而實現對13C同位素標記物的定量分析。以16KG-3∶KG-5016KG-3∶KG-51SQDG為例（圖4），在負離子模式下，提取未標記樣品的總離子流圖（TIC）（圖4a），并對保留時間7.72min、m/z791.4960（圖4b）的分子離子進行二級質譜分析（圖4c），根據該物質產生的特征離子片段（m/z225.0065）和中性丟失而產生的離子＼[M-H-R1COOH＼] （m/z537.2737）和＼[M-H-R2COOH＼] （m/z535.2731），鑒定出該物質為16KG-3∶KG-50～16KG-3∶KG-51SQDG，再根據標記樣品中的TIC圖（圖5a）上對應的保留時間的質譜圖（圖5b），提出各被13C標記過的特征碎片的提取離子圖（EIC）（圖6），將7個峰面積相疊加即為標記組樣品中合成的16KG-3∶KG-5016KG-3∶KG-51SQDG量，總量為6.333×108，將提取離子m/z226.0095，227.0126，228.0170，229.0196，2300235和231.0267的6個峰面積相疊加就是被13C標記上16KG-3∶KG-51～16KG-3∶KG-50SQDG的量，總量為2.703×108，基于此可計算出該脂的標記率約為42.7%。JP

3.3平臺期光合作用脂對13C標記的程度和速度

利用上述的定量方法，將檢測出的各個被13C標記上的SQDG分子的量疊加，即為SQDG被標記上的總量，這樣可很方便計算出不同培養期SQDG標記量的變化（圖7）。同樣也可以計算出另外3類光合作用脂標記量的變化（圖7）。從圖7可見，在整個平臺期DGDG、PG、SQDG被13C標記的總量呈現出先上升后下降的趨勢，并在第8天達到最大值，其含量分別為（173±24）ng/mg藻粉、（473±41）ng/mg藻粉及（1224±21）ng/mg藻粉；而MGDG被13C標記上的總量，隨時間的延長呈持續上升趨勢，并在第10天達到了（956±51）ng/mg藻粉。

在碳源充足及細胞生理功能正常的條件下，硅藻可以通過細胞膜表面的載體蛋白直接把培養液中的H13CO 3運輸到細胞內，然后在碳酸酐酶的作用下轉化為13CO2供光合作用需求，最后大量轉化為脂類[26，27＼]，因而被13C標記上的所有光合作用脂的量持續上升。理論上，隨著培養時間的延長，被13C標記上的各類脂的含量應該增高，而后期13C對光合作用脂標記的量卻下降，可能與培養液中13C的含量、脂類之間轉化及細胞衰敗等因素有關。另外發現從平臺期第4～8天，在相同的時間點都滿足SQDG被13C標記的總量>MGDG被13C標記的總量>PG被13C標記的總量>DGDG被13C標記的總量，在第8天被13C標記SQDG約占所有被13C標記光合作用脂的比高達43.4%，結果與某些硅藻中平臺期SQDG的含量相似[28＼]。Frentzen等[29＼]對微藻中磷脂PG研究發現，在不同的生長時期盡管脂酰基組成變化顯著，但其含量相對穩定，而本實驗中磷脂PG對13C的標記量變化不大，與報道的結果相似。從圖8中可知，DGDG，PG，SQDG的標記率都在第8天達到最高，分別為56.3%，38.4%和62.6%，而MGDG的標記率在第10天達到了87.3%。對比圖7和圖8可知，每類光合作用脂對13C標記的量和相對應的標記率隨培養時間的變化趨勢相近，說明了實驗結果的可靠性。Martin[30＼]通過13C將微藻中的脂類標記，再跟蹤被13C的標記脂肪酸鏈，研究了微藻與橈足類之間的同化關系，但被13C被標記的脂肪酸鏈具體來自哪類脂未能鑒定。此外生物同化微藻體內的脂類主要以甘油酯為活性單元，而非游離的脂肪酸鏈。硅藻細胞內的DGDG、MGDG、SQDG都有典型的環型頭部，理論上通過跟蹤被13C標記環形頭部的轉移來研究微藻和養殖生物之間的同化關系，更加直觀、簡單。不同脂質在藻體內合成的先后時間有差別，進而導致13C標記情況的差異，為了清晰地了解生物攝食過程中對微藻中特定脂類的吸收、自身脂類的合成、轉化、代謝等途徑，我們首先要確定在哪個時期藻體內被13C標記的每類脂質含量的最大化，在該時期投喂生物，進而追蹤該類脂質在攝食動物體內的動態走向，為后期系統闡明微藻對生物脂類影響機制打下脂類營養學理論基礎。因此，對平臺期的小硅藻而言，被13C標記的DGDG、PG、SQDG應選取第8天來投喂養殖生物，而被13C標記的MGDG應選取第10天投喂養殖生物。LM

4結論

本研究將13C穩定同位素示蹤結合高分辨質譜技術，在精確到實際脂類分子結構和組成的組學水平上，通過高分辨液相色譜質譜聯用技術對每一類脂上的同位素標志特性進行分析，并利用二級質譜下脂質形成的特征分子離子，實現13C標記脂質的定量分析，確定在哪個時期藻體內被13C標記的每類脂質含量的最大化.在該時期投喂生物，進而追蹤該類脂質在攝食動物體內的動態走向，為后期進一步研究生物脂類風味形成的分子機理打下脂類營養學理論基礎。所以，針對DGDG、PG、SQDG，應選取標記了8天的微藻來投喂生物；而如果針對MGDG，應選取標記了10天的微藻投喂生物。

References

1（#NIXueWen.Mar.Fish，2005，27（3）：251-255

倪學文.HTK海洋漁業，2005，27（3）：251-255

2DunstanGA，VollmanJK，BarrentSM，LeroiJM，JeffreySW.Photochem，1993，35（1）：155-161

3LIHeFang，ZHOUHanQiu.OceanologiaLimnologiaSinica，1999，30（1）：34-40

李荷芳，周漢秋.HTK海洋與湖沼，1999，30（1）：34-40

4YangF，ChenS，MiaoZ，ShengZ，XuJ，WanJ，RanZ，ZhouL，ZhouH，ZhouC，YanX.Aquac.Nutr.，2015，22（4）：846-856

5RiveroRodríguezS，BeaumontAR，LoraVilchisMC.Aquaculture，2007，263（1）：199-210

6XuJ，ChenD，YanX，ChenJ，ZhouC.Anal.Chim.Acta，2010，663（1）：6068

7LiS，XuJ，ChenJ，ChenJJ，ZhouCX，YanXJ.Aquaculture，2014，428429：104-110

8XuJL，ZhouHB，YanXJ，ZhouCX，ZhuP，MaB.J.Agric.FoodChem.，2012，60（15）：3973-3980

9LeeRF，NevenzelJC，PaffenhfferGA，BensonAA.PattonS.BBA，1970，202（2）：386-388

10RousselJM，PerrierC，ErkinaroJ，NiemelE，CunjakRA，HuteauDandRieraP.Global.Change.Biol.，2014，20（2）：523-530

11SotoDX，WassenaarLI，HobsonKA.Functional.Ecol.，2013，27（2）：535-543

12ReussNS，HamerlikL，VelleG，MichelsenA，PedersenO，BrodersenKP.Limnol.OceanogMeth.，2013，58（3）：440-444

13LiJ，HoeneM，ZhaoX，ChenS，WeiH，LinX，ZengZ，WeigertC，LehmannR，XuG.Anal.Chem.，2013，85（9）：4651-4657

14ElizabethHB，NicholasBB，DamianC，JosephLD，AnitaB，MiguelF，StevenNB，PaulGF，DismukesGC.Bioenerg.Res.，2012，5（4）：876-885

15XUFang，CAIZhaoLing，CONGWei，OUYANGFan.J.ChongqingInstitute.Technol.，2005，19（1）：96-100

徐芳，蔡昭鈴，叢威，歐陽藩.HTK重慶工學院學報：自然科學版，2005，19（1）：96-100

16WEIDong，ZHANGXueCheng，SUIZhengHong，XUHuaiShu.Mar.Sci，2000，24（7）：46-50

魏東，張學成，隋正紅，徐懷恕.HTK海洋科學，2000，24（7）：46-50

17TANGNing，XINGRongLian，QIANZhenMing，WANGChangHai.J.YantaiUniversity：Nat.Sci.EngineeringEdition，2008，21（2）：105-109

湯寧，邢榮蓮，錢振明，王長海.HTK煙臺大學學報：自然科學與工程版，2008，21（2）：105-109

18XuJ，ChenD，YanX，ZhouC.Anal.Chim.Acta，2010，663（1）：60-68

19YanX，ChenD，XuJ，ZhouC.J.Appl.Phycol.，2011，23（2）：271-282

20LiS，XuJ，ChenJ，ZhouC.RapidCommun.MassSpectrom.，2014，28（3）：245-255

21HsuFF，TurkJ.J.Am.Soc.Mass.Spectrom.，1999，10（7）：587-599

22HeinzE，SchmidtH，HochM，JungKH，BinderH，SchmidtR.J.Org.Chem，1989，184（2）：445-453

23RawylerA，MeylanBettexM，SiegenthalerPA.Biochim.Biophys.Acta，1992，1104（2）：331-341

24BenningC.AnnuRev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，1998，49（49）：53-75

25MurphyDJ，WoodrowIE.Biochim.Biophys.Acta，1983，725（1）：104-112

26AxelssonL，RybergH，BeerS.PlantCellEnviron.，2006，18（4）：439-445

27ElzengaJTM，PrinsHBA，StefelsJ.Limnol.Oceanog.Meth，2000，45（2）：372-380

28HarwoodJ.L.MembraneLipidsinAlgae.Berlin：SpringerNetherlands，1988，6：53-64

29FrentzenM.Curr.Opin.Plant.Bio.，2004，7（3）：270-276.

30MartinG，CarolaA，GK.J.Exp.Biol.Mar.Ecol.，2005，317（2）：109-125）

AbstractThediatomNitzschiaclosteriumf.minutissimawasselectedastheobjecttostudythe13Clabeledextentandspeedofphotosynthesislipidsbyultrahighpressureliquidchromatographycoupledwithquadrupoleorbitraphighresolutionmassspectrometry.Theresultsshowedthatallfourtypesoflipidwerelabeledclearlyby13Cwithin10daysinthestationaryphase.Thetotallabeledamountby13Cofdigalactosyldiacylglycerol（DGDG），phosphatidylglycerol（PG）andsulfoquinovosyldiacylglycerol（SQDG）increasedfromenteringthestationaryphasetotheeighthday，butdeclinedlater.AndthetotallabeledamountofDGDG，PGandSQDGreachedthemaximumof（173±24）ng/mg，（473±41）ng/mgand（1224±21）ng/mgontheeighthdaywiththelabeledrateof56.3%，38.4%and62.6%，respectively.Thetotallabeledamountby13Cofmonogalactosyldiacylglycerol（MGDG）showedacontinuedupwardtrendduringthe10days，andreached（956±51）ng/mgonthetenthday，withmarkedrateof87.3%.Itwassuggestedthatthesynthesizedtimeofdifferentlipidwasdifferent.Therefore，forstudyingassimilationmechanismofmicroalgaelipidsbymarineorganisms，thelipidcontentthatlabeledby13Cshouldreachthemaximum.SoifforDGDG，PGandSQDG，weshouldchoosethediatomlabeled8daysby13Ctofeedthemarineorganisms.MeanwhileifforMGDG，weshouldchoosethediatomlabeled10daysby13Ctofeedthemarineorganisms.

KeywordsNitzschiaclosteriumf.minutissima；13Cstableisotope；Quadrupoleorbitrapwithhighresolutionmassspectrometry；Quantitativemarker

HQWT6JY（Received6May2016；accepted8September2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.31172448）.