阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞BCL—6mRNA表達的影響

張潔+石小風+諶新興+賈靜

【摘要】目的：研究阿司匹林對人宮頸癌Hela細胞增殖及BCL-6 mRNA 表達量的影響。方法：不同劑量的阿司匹林干預人宮頸癌 Hela細胞24h后，用MTS法觀察其對人宮頸癌 Hela細胞增殖狀態的影響及采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 檢測阿司匹林作用后 Hela 細胞 BCL-6 mRNA 量的變化。結果：阿司匹林能抑制Hela細胞增殖及促進細胞中 BCL-6 mRNA 的表達，且促進強度隨阿司匹林的濃度的增加而增加。結論：阿司匹林能夠抑制人宮頸癌Hela細胞的生長，并從 mRNA 水平促進 BCL-6 蛋白的表達。

【關鍵詞】 阿司匹林；人宮頸癌 Hela 細胞；BCL-6

【中圖分類號】R73-36+1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0049-03

阿司匹林屬于非甾體抗炎藥的代表藥，是臨床上常用的解熱鎮痛藥。研究發現長期低劑量服用阿司匹林具有預防腫瘤的作用[1]，對腸癌細胞系、乳腺癌、胰島瘤NIT-1細胞、宮頸癌Hela細胞等均有抑制作用[2-4]。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其全球發病率位居女性惡性腫瘤中第2位[5]。其發病是一個多因素、多步驟級連的過程[6]，發病機制尚未完全闡明。BCL-6基因（B cell lymphoma 6，簡稱 BCL-6）是Ye等[7]在 1993年研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時發現的一種原癌基因。在生理條件下，BCL-6 主要表達于生發中心 B 細胞和 CD4T 細胞，調節B細胞活化及分化相關基因如 blimp-1、CD4等[8]、細胞周期調控基因如p27kip1、cyclinD2、炎癥有關的趨化因子基因如MIP-1a 和 IP-10[9]的表達。大量研究發現[10-12]發現BCL-6 在多種腫瘤中表達量增加，并且與腫瘤的增殖、侵襲和遷移密切相關。由于BCL-6與腫瘤密切相關，所以我們推測阿司匹林可能通過促進BCL-6的轉錄表達來抑制宮頸癌Hela細胞的增殖。本研究通過觀察阿司匹林對人宮頸癌 Hela 細胞 BCL-6 mRNA 表達的影響來探究宮頸癌的發病機制。

1儀器與材料

11細胞人宮頸癌 Hela 細胞株，購于武漢博士德生物工程有限公司。

12試劑和藥品RPMI-1640培養基（Gibco公司）；青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗，Gibco公司）；胎牛血清 （FBS，Gibco公司）；二甲基亞砜 （DMSO，Sigma公司）； 0 02% EDTA/0 25% 胰蛋白酶（Gibco公司）；Trizol （Invitrogen公司）；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（promega公司）；GoTaq 2-Step RT-qPCR System （Promaga公司）；其它試劑均為國產分析純。

13儀器二氧化碳培養箱（美國thermo公司）；BX51倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）；T100 Thermal Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）；Eco熒光定量PCR系統（美國Illumina公司）。

14藥物Aspirin（貨號：A2093，SIGMA公司）。

2方法

21阿司匹林溶液的配制與人宮頸癌 Hela 細胞培養

211阿司匹林溶液的配制將40mL完全培養基放至 50mL的離心管中備用；再用電子天平準確稱取72064g的阿司匹林粉末（分子量為 18016），溶于準備好的 40mL完全血清培養基中，用震蕩混勻器充震蕩使其完全溶解，再將pH值調至 71～72，即得 1mol/L 的阿司匹林母液，隨后轉移至超凈臺用 022μm 的微孔過濾器過濾除菌，分裝至小離心管中，置于-20℃冰箱保存，使用時予完全培養基稀釋至不同濃度的阿司匹林25、50、100、200mmol/L。

212人宮頸癌 Hela 細胞培養人宮頸癌 Hela細胞于37℃、飽和濕度、 5% CO2條件下貼壁培養，經025%的胰蛋白酶常規消化后按一定量接種至RPMI-1640培養基（含10% FBS，1%雙抗）中吹散均勻，移入新細胞培養皿，于培養箱中繼續培養，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

22MTS法檢測不同濃度阿司匹林對HeLa細胞的生長抑制率取處于對數生長期的人宮頸癌 Hela細胞經025%的胰蛋白酶常規消化后按按1×104個/孔接種于96孔板內，每孔200μL，接種完畢后，將板置于37℃，含5% CO2的培養箱中貼壁過夜，24h 后，更換培養基為無血清培養基培養24h 后開始進行分組加藥，空白組及對照組再分別加入200μL完全培養基，加藥組分別加入不同濃度阿司匹林的完全培養基各200μL，每組設5個復孔，加藥完畢繼續于培養箱中培養；培養24h后，將板取出，每孔加入40μL MTS溶液，繼續培養1～4h取出96孔板，用酶標儀測定490nm波長處的吸光度，實驗重復3次。計算細胞的生長抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD 值）×100%。

23qRT-PCR 檢測阿司匹林對HeLa細胞中BCL-6 mRNA表達的影響 取處于對數生長期的細胞如前常規消化后按1×106個/孔接種于6孔板內，每孔2mL，接種完畢后，將板置于37℃，含 5%CO2的培養箱中貼壁過夜。次日，分別加藥入不同濃度阿司匹林的完全培養基各2mL，對照組加入2mL完全培養基，加藥完畢繼續于培養箱中培養。取出細胞提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定的RNA的濃度與純度。按GoTaq 2-Step RT-qPCR System說明書進行逆轉錄（反應體系20μL，逆轉錄反應條件：25℃×10min，42℃×60min，70℃×15min，4℃×5min）以及qPCR（反應體系20μL，反應條件：擴增反應條件：95℃×2min，95℃×15sec，60℃×60sec，總共45個循環），實驗重復3次。qPCR引物由北京市金瑞斯生物技術有限公司設計并合成，基因引物見表1。采用相對定量法（2-ΔΔCT法）計算目的mRNA相對表達量。

24統計學方法數據用 SPSS210統計軟件進行統計，采用均數加減標準差（x±s）表示，單因素方差分析，P<005表示差異有統計學意義。

3結果

31阿司匹林對HeLa細胞生長抑制率的影響MTS結果顯示，不同濃度的阿司匹林（25、50、100、200mmol/L）作用HeLa細胞24h后能抑制HeLa細胞的增殖，與對照組相比差異具有統計學意義（P<005），且呈劑量依賴性，即其抑制率隨濃度的增大而逐漸增加。見圖1、表2。

32阿司匹林對HeLa細胞中BCL-6 mRNA表達的影響qRT-PCR結果顯示，不同濃度的阿司匹林（0、25、50、100、200mmol/L）作用HeLa細胞24h后能促進HeLa 細胞中BCL-6 mRNA表達，與對照組相比差異具有統計學意義（P<005），且呈劑量依賴性，即其促進程度隨濃度的增大而逐漸增加。見圖2。

4討論

原癌基因BCL-6屬于抗細胞凋亡家族，編碼核轉錄抑制蛋白，在生發中心B細胞和具有生發中心B細胞表型的淋巴瘤中高表達。BCL-6的主要功能是轉錄抑制作用，受BCL-6調控的靶基因主要與細胞活化、分化和增生相關。研究發現BCL-6在多種腫瘤中有高表達，且與腫瘤的增殖、侵襲等密切相關[10-12]。BCL-6在彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等淋巴瘤中顯著高表達，且已成為彌漫大B細胞淋巴瘤的診斷標志物之一[13-14]。

宮頸癌是發生在全球婦女中僅次于乳腺癌的第二常見的惡性腫瘤。我國宮頸癌發病率已高居世界第二位，僅次于智利，且發病年輕化趨勢明顯，因此研究宮頸癌的發病機制、治療、預防是一大熱點。目前認為宮頸癌的發病主要與HPV感染引起機體內源性因素產生影響，如相關癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表達和機體免疫調節機制失衡等一系列病理改變，引起細胞增殖與凋亡調節異常，導致組織癌變。阿司匹林是非甾體抗炎藥 （NSAIDs），可以通過抑制COX和NOS-2激活等途徑來預防和抑制腫瘤的作用[15]。實驗研究[16-18]也確實證明了阿司匹林能夠抑制宮頸癌細胞的增殖與凋亡，但具體機制不詳。

基于原癌基因BCL-6與宮頸癌發生發展的相關性，本項目組進行了此次實驗，實驗結果表明阿司匹林具有明確的抗宮頸癌的作用，并且該作用可能與其促進BCL-6的表達有關。其促進作用于阿司匹林的濃度呈正相關，但是阿司匹林是如何通過促進BCL-6表達來抑制宮頸癌的還需進一步的深入研究。

參考文獻

[1]Peter M Rothwell，F Gerald R Fowkes，Jill FF Belch，et al.Effect of daily aspirin on long-term risk of death due to cancer： analysis of individual patient data from randomised trials[J]. The Lancet，2011（59）：31.

[2]Goel A，Chang KD，Ricciardiello L，et al.A novel mechanism for aspirin-mediated growth inhibition of human colon cancer cells[J]. Clinical Cancer Reaearch，2003（91）：383.

[3]孫情，馮喬，熊毅，等.阿司匹林對胰島瘤細胞株NIT-1細胞增殖及NF-κB表達的影響[J]. 中國糖尿病雜志，2012（11）：862.

[4]李盛，嚴浩，黃志琨.阿司匹林誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡及機制[J]. 中國醫院藥學雜志，2012（9）：675.

[5]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2） ： 69.

[6]曾康康，莫祥蘭，劉斐，等.宮頸癌及癌前病變阻滯中 microRNAs 的差異表達[J].腫瘤防治研究，2014，41（7） ： 789.

[7]Ohtani M， Miyadai T. Functional analysis of fish BCL-6 and Blimp-1 in vitro： transcriptional repressorsfor B-cell terminal differentiation in fugu （Takifugu rubripes）[J]. Mol Immunol， 2011， 48（7）： 818.

[8]Shaffer AL， Yu X， He Y， et al. BCL-6 represses genes that function in lymphocyte differentiation， inflammation， and cell cycle control[J]. Immunity， 2000， 13（2）： 199–212.

[9]Salamon D， Adori M， He M， et al. Type I interferons directly down-regulate BCL-6 in primary and transformed germinal center B cells： differential regulation in B cell lines derived from endemic or sporadic Burkitt's lymphoma[J]. Cytokine， 2012， 57（3）： 360-371.

[10]馮慧琳，譚明子，朱連成，等.BCL6與Lewis y在卵巢漿液性腫瘤中的表達及其臨床意義[J].現代腫瘤醫學，2016（13）：2127-2132.

[11]劉雪，吳正升，吳強. 乳腺癌細胞中miR-339-5p對BCL-6表達的調節[J]. 臨床與實驗病理學，2013（3）：244-246.

[12]朱琳，鄭胡鏞，劉瀟，等. BCL6、KLF5、NCL基因在兒童急性淋巴細胞白血病中異常表達的特點[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2011（4）：362-367.

[13]Salamon D， Adori M， He M， et al. Type I interferons directly down-regulate BCL-6 in primary and transformed germinal center B cells： differential regulation in B cell lines derived from endemic or sporadic Burkitts lymphoma[J]. Cytokine， 2012， 57（3）： 360.

[14]Cerchietti L C， Hatzi K， Caldas-Lopes E， et al. BCL6 repression of EP300 in human diffuse large B cell lymphoma cells provides a basis for rational combinatorial therapy[J]. J Clin Invest， 2010， 120（12）：4569.

[15]Coyle C， Cafferty FH， Langley RE. Aspirin and Colorectal Cancer Prevention and Treatment： Is It for Everyone[J]. Curr Colorectal ancer Rep，2016（12）：27.

[16]王蓓，王曉，李建立，等. 阿司匹林對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用[J]. 中國老年學雜志，2013（9）：2081.

[17]鄭秀娟，李淞漪. 阿司匹林對宮頸癌Hela細胞COX-2 mRNA表達的抑制作用[J]. 浙江臨床醫學，2007，11：1461.

[18]王蓓，邢邯英，李建立，等. 阿司匹林對宮頸癌Hela細胞凋亡及增殖的影響[J]. 中國老年學雜志，2014（9）：2459.