小半夏加茯苓湯醇提物對BGC—823細胞線粒體凋亡通路的影響

閆文娟+賈亞玲+陳麗麗+何前松+馮泳

【摘要】目的： 觀察小半夏加茯苓湯醇提物對胃癌細胞BGC-823的凋亡作用以及誘導其凋亡發生的機制。方法：運用MTT法檢測不同濃度的小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823的增殖抑制作用并計算抑制率；以羅丹明123為細胞染色劑，采用流式細胞術檢測線粒體跨膜電位的改變；實時熒光定量PCR檢測Bax、Bcl-2和Cyt-c表達的變化。結果：MTT結果顯示小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823具有抑制作用，隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸升高，細胞活力逐漸減弱，與空白對照組比較有顯著統計學差異（P<001）。流式細胞術結果顯示，與空白對照組相比，小半夏加茯苓湯醇提物能夠顯著降低線粒體跨膜電位（P<001）；qRT-PCR結果顯示，Bax基因表達顯著升高（P<001），Cyt-c基因表達升高（P<005），Bcl-2基因的表達降低（P<005）。結論：小半夏加茯苓湯醇提物可以抑制BGC-823細胞活力，誘導細胞凋亡并減小Bcl-2/Bax基因表達比例，增強Cyt-c基因表達，其機制可能與線粒體為核心的凋亡通路相關。

【關鍵詞】小半夏加茯苓湯；胃癌細胞BGC-823；凋亡；線粒體；

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0042-04

胃癌作為常見的消化道系統腫瘤之一，其發病率和死亡率在中國排名第三[1]。胃癌的治療方法包括手術、放療、化療，但放化療引起的惡心、嘔吐、食欲不振等消化道反應，如果未得到有效的控制，將降低胃癌患者的依從性及生存質量而放棄治療。小半夏加茯苓湯（Xiao Banxia plus Fuling Decoction，XBFD）源于《金匱要略》，全方由半夏、生姜、茯苓組成，現代研究證實半夏、生姜、茯苓三味藥均有不同程度的抗腫瘤作用[3-5]。具有散飲降逆、和胃止嘔的作用，臨床上對于化療所致的遲發性嘔吐癥狀有明顯療效，較甲氧氯普安療效更好[2]。在辨證論治痰證腫瘤時亦常用到半夏、生姜、茯苓三味藥，為了進一步明確小半夏加茯苓湯復方抗腫瘤的作用機理，本實驗以胃癌細胞BGC-823為對象，運用流式細胞術、實時熒光定量PCR（Real Time PCR，RT-qPCR）等方法，檢測線粒體跨膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP）以及相關基因表達的變化。

1材料與儀器

11材料與試劑人胃癌細胞BGC-823系購自上海細胞庫。小半夏加茯苓湯醇提物（取生半夏18g，茯苓9g，生姜15g，50%乙醇于85℃水浴鍋中提取，搖勻，干燥后稱取15g小半夏加茯苓湯醇提物干粉，用50mL 50%乙醇溶解，得30mg/mL母液，稀釋后使用[6]）、高糖DMEM培養基、胰蛋白酶、雙抗、磷酸鹽緩沖液均購自美國Hyclone公司、胎牛血清購自美國Gibco公司、四甲基偶氮唑藍（MTT）、羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123）均購自美國Sigma公司、Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司、RNA提取試劑盒購自天根生化公司、Thermo ScientificMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 購自 Thermo Scientific公司、引物由上海生工公司合成。

12主要儀器二氧化碳培養箱（Thermofisher，USA）、低溫高速離心機（Beckman Coulter，USA）、多功能酶標儀（BioTek Synergy H4，USA）、流式細胞儀（BD，USA）、NanoDrop2000（Thermofisher，USA）、實時熒光定量PCR儀（ABI ViiA7TM Dx Fast，USA）。

2方法

21細胞培養和分組BGC-823細胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養液，置于37℃、5%CO2培養箱內常規培養。將細胞分為小半夏加茯苓湯醇提物組（800μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400μg/mL），同時設不加藥物的完全培養液為空白對照組和乙醇溶劑對照組。分別檢測12、24h的實驗結果。

22MTT 法檢測細胞增殖抑制率取對數生長期的胃癌細胞BGC-823以6×104/孔接種于96孔板，預先設定調零組、空白對照組、乙醇溶劑對照組和給藥組，給藥組分別加入不同濃度的XBFD醇提物，乙醇溶劑對照組加入與800μg/mL實驗組等量的50%乙醇，每個組至少設三個平行孔。分別培養12h、24h后，每孔加入200μl 含濃度為5mg/mL MTT的培養液，37℃孵育4h后，棄液后加入DMSO 150μl，振蕩器充分振蕩后以490nm波長測定各孔吸光度（OD），并記錄結果計算抑制率。抑制率=[1-（給藥組OD值-調零組OD值）/（空白組OD值-調零組OD值）]×100%。

23流式細胞術檢測（Flow Cytometry，FCM）MMP的改變取對數生長期的BGC-823細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，設實驗組為終濃度600μg/mL的XBFD醇提物溶液，空白對照組加入與實驗組等量的50%乙醇，相同的條件下分別培養12h，24h。收集上清，用預冷的PBS洗滌細胞3遍，收集洗滌液，按AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，并加入5μlRh123染色，常溫避光孵育10-30min后，上流式細胞儀檢測，每個樣本檢測10000個細胞，測定相對熒光強度，以熒光強度的變化表示線粒體膜電位的變化。

24qRT-PCR法檢測bax、Bcl-2和細胞色素C（Cytochrome C，Cyt-c） mRNA的相對表達量收集并提取經600μg/mL的XBFD醇提物處理24h后的BGC-823細胞總RNA，紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，并以此cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL：2μL cDNA模板，2×SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 10μL，水9μL，上下游引物各075μL。引物設計詳見表1。實驗操作按產品說明書進行，PCR反應條件為：50℃2min，95℃10min，（95℃ 15sec，60℃ 30sec，92℃ 30sec）×40個循環。反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，根據qRT-PCR檢測結果，分析得出各個樣品量的循環閾值（Ct），以β-actin作為內參照，實驗設有 3 次重復，采用2-△△CT法計算mRNA的相對定量分析。

25統計學方法所有數據均采用SPSS230軟件進行分析處理，計量資料用（x±s）表示，各組間差異采用One-Way ANOVA分析，P<005為差異有統計學意義。

3結果

31不同濃度XBFD醇提物對胃癌細胞增殖的影響不同濃度的XBFD醇提物作用于胃癌細胞系BGC-823后，胃癌細胞增殖抑制率見表2，圖1。圖1顯示XBFD醇提物對BGC-823細胞活力的影響呈現“濃度-時間依賴性”的關系，即隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，對細胞的增殖抑制率逐漸升高，細胞活力逐漸減弱，具有統計學差異（P<001）。

32XBFD醇提物對BGC-823 MMP的影響XBFD醇提物作用BGC-82312h、24h后，實驗組熒光強度顯著高于空白對照組（見表3，圖2），提示MMP明顯降低，實驗組與空白對照組差異具有統計學意義（P<001）。

33XBFD醇提物對BGC-823凋亡相關基因bax、Bcl-2和Cyt-c基因的影響采用qRT-PCR方法，檢測600μg/mL的小半夏加茯苓醇提物干預BGC-823 24h后，細胞內Bax、Bcl-2和Cyt-c基因相對表達量的變化。Bax基因檢測結果表明與空白對照組相比，實驗組中Bax基因相對表達量變化明顯升高（P<001），Cyt-c基因相對表達量變化升高（P<005）；Bcl-2相對表達量變化降低（P<005）（見表4）。

4討論

中醫學認為胃癌屬于“胃反”、“噎嗝”、“胃脘痛”、“積聚”、“伏梁”等癥的范疇，其病機與脾胃虛弱、痰濁阻滯有關[7]。痰飲與腫瘤關系密切[8]，諸多醫家提倡腫瘤當“從痰飲論治”[9]，“當以溫藥和之”[10]。痰飲的治療大法首載于《金匱要略》，并用小半夏加茯苓湯作為治療痰飲的名方。小半夏加茯苓湯用于臨床的止嘔研究較多，但對抗腫瘤作用機理的研究較少。本課題組前期研究表明，該復方對于腫瘤細胞有促凋亡和提高機體免疫力的作用。楊長福等[11]發現小半夏加茯苓湯可抑制HepG2細胞增殖及促進凋亡，機制可能通過激活caspase-3蛋白表達，阻滯細胞周期于S期，從而誘導肝癌細胞凋亡。何前松等[12]發現小半夏加茯苓顆粒含藥血清可下調SGC-7901細胞Bcl-2基因表達，抑制細胞生長增殖，其作用機制可能與誘導細胞凋亡或細胞毒作用有關。蔡琨等[13]發現小半夏加茯苓顆粒可增強荷瘤小鼠的免疫功能，抑制模型鼠腫瘤的生長，具有一定的腫瘤抑制及免疫調節作用。本實驗以BGC-823為研究對象，采用小半夏加茯苓湯醇提物用于體外實驗，實驗結果顯示，小半夏加茯苓湯醇提物對BGC-823細胞具有增殖抑制作用，并且呈現出明顯的量效時效關系。

細胞凋亡信號轉導通路主要包括內源途徑（又稱線粒體凋亡途徑）、外源途徑（又稱死亡受體凋亡途徑）以及非依賴caspase凋亡途徑[14]。在細胞接受凋亡信號后，線粒體膜電位降低可以使線粒體內釋放一系列凋亡因子可引起如Cyt-c和Apaf-1等到細胞質中， 激活下游的caspase家族， 促使細胞凋亡的發生[15]。本實驗選擇羅丹明123染色后流式細胞術檢測線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，導致熒光強度減弱或消失，而在細胞發生凋亡時，線粒體膜完整性被破壞，引起線粒體跨膜電位的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發出強黃綠色熒光[16]。FCM結果顯示，給藥組細胞熒光強度增強，提示XBFD醇提物能夠降低線粒體跨膜電位，說明XBFD醇提物誘導腫瘤細胞發生凋亡其中途徑之一可能與損傷腫瘤細胞的線粒體相關。

Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要因子，與腫瘤的發生息息相關[17]。正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上，當細胞接受凋亡信號時，Bax能自身形成同源二聚體（Bax/Bax）促進Cyt-c的釋放，促進細胞凋亡[18]。Bcl-2位于線粒體外膜，Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體（Bcl-2/Bax）以抑制細胞凋亡。因此Bcl-2/Bax比例是決定細胞凋亡與否的關鍵因素。當Bcl-2/Bax值降低時，細胞凋亡趨勢增加[19]。本實驗中促凋亡基因Bax在小半夏加茯苓湯誘導的胃癌細胞BGC-823中的表達上調，Bcl-2的表達下調，Bcl-2/Bax比例減小，使線粒體膜電位降低，通透性增強，細胞凋亡相關因子和Cyt-c被大量釋放到胞質中，導致BGC-823細胞啟動線粒體途徑發生凋亡。

因此，小半夏加茯苓湯對人胃癌BGC-823細胞有生長抑制和誘導凋亡作用，其誘導凋亡機制可能與線粒體損傷同時伴隨下調Bcl-2/Bax比例，促進Cyt-c大量釋放有關。但細胞凋亡是一個復雜的過程，具體機制還需進一步研究。

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