雙黃連口服液化學成分含量測定及指紋圖譜研究

馮宏玲+黃森+李穆睿+張慧+于思慧+韓麗

【摘要】目的：測定雙黃連口服液化學成分含量，建立化學成分指紋圖譜的研究，為雙黃連口服液質量標準研究提供理論依據。方法：采用高效液相色譜法，Agilent C18色譜柱（250mm×46mm，5μm），流動相為甲醇（A）-025%冰乙酸（B），流速為10mL/min；柱溫為30℃；進樣體積為10μL。結果：測定雙黃連口服液中化學成分含量并建立了指紋圖譜，標定12個共有峰，以9號峰（即黃芩苷）為參照。方法學考察符合規定，RSD均小于30%。結論：建立了以黃芩苷、連翹苷和綠原酸為參照物，測定不同廠家的雙黃連口服液的含量及化學指紋圖譜方法，結果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性，此方法簡便，重現性好，精密度高，可以為雙黃連口服液質量標準提供一定的依據。

【關鍵詞】雙黃連口服液；高效液相色譜法；含量測定；指紋圖譜

【中圖分類號】R284【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0017-06

雙黃連口服液是臨床抗菌抗病毒常用藥，由金銀花、黃芩和連翹三味中藥提取精制而成，具有抑菌[1]、抗病毒[2-3]、解熱抗炎[4]的作用，用于治療外感風熱所致的感冒，癥見發熱頭痛、咳嗽及咽痛等。此三味中藥主要成分為綠原酸、黃芩苷以及連翹苷，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調節等作用[5]，黃芩苷具有抗菌抗病毒、解熱鎮痛抗炎、清除氧自由基等作用[6]，連翹苷具有抗菌抗病毒、抗炎、保肝等作用[7]，這三種化合物是雙黃連口服液中主要活性及藥效成分。目前用高效液相色譜法來測定雙黃連口服液中的有效成分是主要的檢測方式[8-10]，且指紋圖譜是國內外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質量的非常有效的手段。因此有必要對不同廠家及批次的制劑中這三種成分的含量及指紋圖譜進行研究，為此建立了本文的研究方案，可能會對控制藥品質量、保證人民用藥的安全有效起到積極的作用。

1儀器與材料

11儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元泵，DAD 檢測器，柱溫箱，工作站，安捷倫科技有限公司）；AR2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；METTLER AB135-S十萬分之一電子天平（瑞士）；超聲提取儀（240W，50-60Hz，上海必能超聲儀器公司）。

12材料連翹苷（批號：110821-201213）、綠原酸（批號：110753-201314）、黃芩苷（批號：110715-201117）等對照品購自中國食品藥品檢定研究院。純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），甲醇等試劑均為色譜純。藥品見表1。

2化學成分含量測定

雙黃連口服液是由金銀花、黃芩、連翹三種藥材制成的中藥制劑，金銀花中有效成分主要為綠原酸、黃芩中有效成分主要為黃芩苷、連翹中有效成分主要為連翹苷，中國藥典也以這三種成分作為指標性成分[11]，以3種成分為指標，建立了雙黃連口服液的含量測定方法。

21色譜條件梯度洗脫：0～8min，A（15%～30%）-B（85%～70%）；8～15min，A（30%～35%）-B（70%～65%）；15～20min，A（35%～53%）-B（65%～47%）；20～45min，A（53%～63%）-B（47%～37%）；45～65min，A（63%～100%）-B（37%～0%）；檢測波長：280nm。

22對照品溶液制備分別精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，用50%甲醇制成01822、0053、118mg/mL的混合對照品溶液，045μm微孔濾膜濾過，即得。

23供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量內容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045μm微孔濾膜濾過，即得。

24陰性對照溶液制備取除去金銀花、連翹、黃芩藥材，按雙黃連口服液制備工藝制備陰性藥品，按供試品溶液制備方法操作，制成缺失金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液，備用。

25方法學考察

251專屬性試驗取金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液分別注入液相色譜儀，測定色譜峰，結果顯示，金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液色譜中在與供試品色譜中綠原酸、連翹苷、黃芩苷相同保留時間處，未見色譜峰，表明金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液無干擾。結果見圖1、2、3。

252線性關系考察精密量取上述混合對照品溶液2、4、8、10、14、16 μL注入液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。黃芩苷標準曲線方程Y=18909X+63468，R=09997，線性范圍為236μg～1888μg。精密量取上述混合對照品溶液5、75、10、15、20 μL注入液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。綠原酸標準曲線方程Y=12898X+19970，R=09998，線性范圍為0911μg～3644μg。連翹苷標準曲線方程Y=12152X+52111，R=09997，線性范圍為053～106μg。

253中間精密度試驗由3個不同實驗人員，分別在3天，取雙黃連口服液（S-2），精密量取5mL，按“23” 項下制備供試品溶液，按“21”項下色譜條件，每人重復測定2次，計算含量。結果顯示，RSD小于15%，表明中間精密度良好。

254穩定性試驗取雙黃連口服液（S-2），按“23” 項下制備供試品溶液，按“21”項下色譜條件分別在提取后 0、2、4、6、8、10h取樣，分別注入色譜儀，測定色譜峰面積。結果表明，供試品溶液在配制完成后的10h內色譜峰面積無明顯變化，表明在10h內供試液溶液穩定。

255重復性試驗取雙黃連口服液（S-2）6份，按“23” 項下制備供試品溶液，按“21”項下色譜條件進樣分析，測定色譜峰面積，計算含量，RSD小于3%，結果顯示，6次測定結果的重復性良好。

256準確度試驗精密量取6份已知含量的雙黃連口服液（S-2）025mL，置10mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷（118mg/mL）5mL、綠原酸（01822mg/mL）5mL和連翹苷（0053mg/mL） 5ml對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，注入色譜儀，測定峰面積，計算回收率。結果顯示，3個成分的含量的回收率均在95%～105%之間。

27含量測定按“24”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，采用外標法計算含量。11個不同廠家雙黃連口服液含量測定結果有一定差異，其黃芩苷含量在15055～34614mg/mL范圍內，連翹苷在0589～2072mg/mL范圍內，綠原酸在0694～5781mg/mL范圍內，均滿足《中國藥典》2015版一部的含量限度要求，其中S-7（匯利）3種成分的總量最低。結果見表2。

3雙黃連口服液指紋圖譜的建立

31供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量內容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045μm微孔濾膜濾過，即得。

32參照物溶液制備分別精密稱取黃芩苷1401mg、綠原酸424mg、連翹苷503mg，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，分別制得黃芩苷標準品溶液1401mg/mL、綠原酸0424μg/mL、連翹苷0503mg/mL。

33陰性溶液的制備取除去雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照溶液，備用。

34色譜條件色譜柱：Agilent C18色譜柱（250mm×46mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-025%冰乙酸（B）；梯度洗脫：0～8min，A（15%～30%）-B（85%～70%）；8～15min，A（30%～33%）-B（70 %～67 %）；15～20min，A（33%～40%）-B（67%～60%）；20～40min，A（40%～43%）-B（60%～57%）；40～50min，A（43%～47%）-B（57%～53%）；50～70min，A（47%～100%）-B（53%～0%）。流速：10mL/min；柱溫：30℃；進樣體積： 10μL；檢測波長：278nm。

35參照物的確定通過測定11批不同廠家的雙黃連口服液供試品，制劑的色譜峰均在70min之內出現，由于對照品黃芩苷、綠原酸、連翹苷為已知成分，且11批制劑中均存在，因此選擇這3個峰作為雙黃連口服液的參照峰。參照色譜圖見圖4。

36共有指紋峰的標定分別測定陰性溶液與供試品溶液，并且進行比較，排除陰性干擾峰，以黃芩苷、綠原酸、連翹苷為參照物，選擇11個廠家雙黃連口服液指紋圖譜中保留時間與參照物相對比的相對保留時間一致的峰做為共有指紋峰，在《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》中導入11批不同廠家雙黃連口服液的指紋圖譜，對保留時間進行相似度評價。結果顯示，最終確定共有指紋峰12個，相似度均大于099，經計算，每個廠家供試品溶液中色譜圖中的共有峰的峰面積之和大于90%，符合共有峰標定要求，共有峰色譜圖見圖5、6、7，相似度評價見表3。結果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性。

37方法學考察

371精密度試驗取供試品溶液，連續進樣6次，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中導入色譜圖，得到6個圖譜的相似度。結果表明，圖譜的相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明精密度良好。

372穩定性試驗取雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、6、8、10h進樣，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結果，各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中導入色譜圖，得到圖譜相似度。結果表明，10h內圖譜相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明穩定性良好。

373重復性實驗取同一批號雙黃連口服液6份，按供試品溶液制備方法處理，分別注入色譜儀，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中導入色譜圖，得到圖譜相似度。結果表明，圖譜的相似度均大于097，符合指紋圖譜分析要求，表明重復性良好。

4討論

41分別以乙腈-水、甲醇-水等不同比例的流動相系統進行等度和梯度洗脫試驗。結果表明，用甲醇-025%冰乙酸水溶液進行梯度洗脫可同時將三個有效成分黃芩苷、連翹苷、綠原酸在同一個色譜條件下分開，且分離度較好，為此選用文中流動相。

42本法對雙黃連口服液中3種成分同時測定，解決了《中國藥典》中采用3個色譜條件分別測定黃芩苷、連翹苷、綠原酸含量的方法的繁瑣性，操作簡便，提高了雙黃連口服液含量測定效率。

43建立了雙黃連口服液指紋圖譜，標定了12個共有峰，以9號峰（即黃芩苷）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0200），2號（0220），3號（0287），4號（0358），5號（0447），6號（0554），7號（0713），8號（0859），9號（1000），10號（1285），11號（1321），12號（1465），方法學考察符合規定，RSD均小于30%；以3號峰（即綠原酸）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0692），2號（0760），3號（1），4號（1233），5號（1558），6號（1910），7號（2481），8號（2962），9號（3463），10號（4432），11號（4536），12號（5058），方法學考察符合規定，RSD均小于30%。以8號峰（即連翹苷）為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號（0234），2號（0257），3號（0338），4號（0416），5號（0526），6號（0645），7號（0837），8號（1），9號（1169），10號（1496），11號（1531），12號（1707），方法學考察符合規定，RSD均小于30%。證明此方法可行。

44從11批不同廠家雙黃連口服液指紋圖譜相似度結果可以看出，不同廠家的雙黃連口服液特征圖譜相似度較高。但是，各共有特征峰相對峰面積存在差異，說明不同廠家雙黃連口服液之間存在質量差異。

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