B細胞易位基因1在腦膠質瘤組織中的表達及意義

韓小輝 連亞軍

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

B細胞易位基因1在腦膠質瘤組織中的表達及意義

韓小輝 連亞軍

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

目的 探討B細胞易位基因1(BTG1)和人10號染色體磷酸酶張力蛋白樣同源物(PTEN)在腦膠質瘤組織中的表達及其與腫瘤分級的關系和意義。方法 采用免疫組織化學染色(EnVision法)分別檢測80例腦膠質瘤及25例正常腦組織中BTG1和PTEN的表達，并采用Western blot檢測隨機抽取的4例腦膠質瘤及4例正常腦組織中二者的表達。結果 BTG1在膠質瘤和正常腦組織中的陽性表達率分別為73.8%、96.0%，PTEN在腦膠質瘤的表達率分別為77.5%、100%，差異均具有統計學意義(P<0.05)；二者的表達與世界衛生組織(WHO)膠質瘤組織學分級呈負相關(P<0.05)，但與患者性別及腫瘤直徑無關(P>0.05)。結論 BTG1和PTEN在膠質瘤的發生及發展過程中起重要作用，二者表達檢測可為腫瘤的組織學分級提供參考，也提示BTG1和PTEN作為新型抑癌基因可能成為膠質瘤基因治療的新靶點。

BTG1；PTEN；膠質瘤

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，占所有成人原發惡性腦腫瘤的50%[1]。WHO(2007)將其劃分為Ⅰ～Ⅳ級：低級別膠質瘤(Ⅰ級和Ⅱ級)常見于兒童和年輕人，高級別膠質瘤(Ⅲ級和Ⅳ級)常見于中老年人[2]。其中Ⅳ級膠質瘤即膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)惡性程度最高，盡管在過去數十年中新的檢測和治療手段不斷出現，GBM患者的中位生存期仍變化不大，僅限于12～15個月[1]。近年來分子生物學的快速發展也推動膠質瘤治療的不斷進步，分子靶向治療成為腦膠質瘤治療的研究熱點。因此，從基因水平分析腦膠質瘤的生物學特性，探索其診療技術成為新的研究方向。研究發現，B細胞易位基因1(B-cell translocation gene 1，BTG1)在多種惡性腫瘤中具有抑制腫瘤細胞增殖的作用[3-7]，由此推測BTG1可能也在腦膠質瘤的形成和發展中具有重要作用。人10號染色體磷酸酶張力蛋白樣同源物(PTEN)也與腦膠質瘤的發生發展有密切關系，并成為新的治療靶點的研究熱點。本研究采用免疫組化和Western blot方法檢測并分析BTG1和PTEN在腦膠質瘤中的表達及其與臨床病理參數的關系，以期為腦膠質瘤的臨床治療找到新的基因靶點。

1 材料與方法

1．1 一般資料 收集鄭州大學第一附屬醫院2013-12—2016-04行腫瘤全切的80例膠質瘤組織標本，并選取25例顱腦減壓所得正常腦組織作對照。80例膠質瘤患者年齡1～70歲，平均37.2歲，其中≤20歲21例，>20歲59例；男45 例，女35例；腫瘤平均直徑4.5 cm，直徑≤3 cm 11例，>3 cm 69例；組織學分級Ⅰ～Ⅳ級各20例。患者術前均未接受放、化療，新鮮膠質瘤標本及正常腦組織標本各4例，部分用于病理學分析，部分凍存于液氮中用于后續的Western blot分析。

1．2 免疫組織化學染色 標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切片4 μm。BTG1兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab197376)；PTEN兔抗人多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術公司(ZA-0251)；免疫組化二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。免疫組織化學染色采用EnVision法，按照說明書進行。結果判定：每張切片隨機選擇5個視野，每個標本計數3張切片。BTG1表達以陽性細胞百分比與細胞染色強度得分之和進行判定。陽性細胞百分比分為：≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計2分，>75%計4分；細胞染色強度：無染色記0分，弱染色(淺黃色)計1分，中等染色(黃褐色)計2分，強染色(棕黃色)計3分。兩項評分相加：0～1分為陰性(-)，2～7分為陽性，其中2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。BTG1以肺癌組織為陽性對照，PTEN以前列腺癌組織為陽性對照；PBS替代一抗作為陰性對照。

1．3 Western blot檢測 組織裂解液、SDS-PAGE上樣緩沖液及增強型ECL化學發光試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術公司。隨機選取4例新鮮的腦膠質瘤組織及正常腦組織，用玻璃勻漿器充分勻漿，加入裂解液提取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，按每孔上樣量60 μg進行丙烯酰胺凝膠電泳，穩壓冰浴電轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜(BTG1 1：500；PTEN 1：1 000；β-action 1：5 000)，TBST洗3次/5 min，二抗(羊抗兔1： 5 000)室溫孵育1 h，TBST室溫搖床洗3次/5 min，ECL化學發光后AI600系統檢測。

1．4 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。多組間數據比較采用Kruskal Wallist檢驗；相關分析采用Spearman秩相關檢驗；BTG1和PTEN蛋白表達與臨床參數之間的關系分析采用Logistic回歸分析。所有實驗數據均至少重復3次，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 BTG1蛋白在膠質瘤組織中的表達情況 BTG1陽性表達主要定位于細胞漿，呈淺黃色、黃褐色或棕黃色染色。BTG1在正常腦組織中的陽性表達率較高，表達率為96.0% (24/25)，且表達較強，而在膠質瘤的陽性表達率降低，表達率為73.8% (59/80)，且表達減弱，二者差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 正常腦組織及膠質瘤中BTG1 的表達情況(EnVision 法，細胞質表達，高倍放大) A：正常腦組織 BTG1強陽性表達；B：膠質瘤Ⅰ級(毛細胞星形細胞瘤)，BTG1強陽性表達；C：Ⅱ級膠質瘤(肥胖型星形細胞瘤)，BTG1陽性表達；D：Ⅲ級膠質瘤(間變型星形細胞瘤)，BTG1弱陽性表達；E：Ⅳ級膠質瘤(膠質母細胞瘤)，BTG1幾乎不表達；F：BTG1在正常腦組織及膠質瘤中的免疫組化表達評分值的比較，與正常組織相比，膠質瘤Ⅰ級無顯著差異(P>0.05)，膠質瘤Ⅱ～Ⅳ級均有顯著差異(P<0.05)；膠質瘤Ⅰ～Ⅳ級之間兩兩相比，Ⅲ級與Ⅳ級質之間無明顯差異(P>0.05)，其余均有顯著差異(P<0.05)

2．2 PTEN蛋白在膠質瘤組織中的表達情況 PTEN陽性表達主要定位于細胞漿，呈淺黃色、黃褐色或棕黃色染色。PTEN在正常組織中的陽性表達率較高，表達率為100% (25/25)，且表達較強，而在膠質瘤的陽性表達率降低，表達率為77.5%(62/80)，且表達減弱，二者差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 BTG1和 PTEN蛋白在膠質瘤及正常組織中的表達 [n(%)]

注：與正常組織比較，1)P<0.05

2．3 BTG1和PTEN蛋白的表達與膠質瘤臨床病理參數的關系 BTG1和PTEN蛋白的表達與腦膠質瘤組織學WHO分級的關系的分析結果顯示腦膠質瘤組織中二者的表達與腫瘤組織學WHO分級呈負相關(P<0.05)，腫瘤級別越高表達率越低且表達強度下降。各級膠質瘤及正常腦組織之間BTG1和PTEN表達分別兩兩比較(Kruskal Wallist檢驗)顯示，Ⅰ級膠質瘤與正常腦組織相比無顯著差異(P>0.05)，Ⅲ級和Ⅳ級相比無顯著差異(P>0.05)；其余各組之間相比均有顯著差異(P<0.05)。BTG1和PTEN之間的相關分析 (Spearman秩相關檢驗)顯示二者表達呈正相關；Logistic回歸分析顯示BTG1和PTEN蛋白在20歲以上患者比20歲以下患者的表達率及表達強度下降(P<0.05)；但二者的表達與腫瘤直徑及患者性別無關(P>0.05)。 見表2。

圖2 正常腦組織及膠質瘤中PTEN 的表達情況(EnVision法，細胞質表達，高倍放大) A：正常腦組織PTEN強陽性表達；B：膠質瘤Ⅰ級(毛細胞星形細胞瘤)，PTEN強陽性表達；C：Ⅱ級膠質瘤(肥胖型星形細胞瘤)，PTEN陽性表達；D：Ⅲ級膠質瘤(間變型星形細胞瘤)，PTEN弱陽性表達，毛細血管內皮細胞強陽性表達；E：Ⅳ級膠質瘤(膠質母細胞瘤)，PTEN幾乎不表達；F：PTEN在正常腦組織及膠質瘤中的免疫組化表達評分值比較，與正常組織相比，膠質瘤Ⅰ級無顯著差異(P>0.05)，膠質瘤Ⅱ～Ⅳ級均有顯著差異(P<0.05)，膠質瘤Ⅰ～Ⅳ之間兩兩相比，Ⅲ級與Ⅳ級質之間無明顯差異(P>0.05)，其余均有顯著差異(P<0.05)

2．4 腦膠質瘤和正常腦組織中BTG1和PTEN蛋白的表達分析 Western blot結果顯示，膠質瘤組織中BTG1和PTEN蛋白的表達低于正常腦組織(圖3)，與免疫組織化學的結果一致 (圖4)。

表2 BTG1和 PTEN蛋白與膠質瘤患者臨床特征的關系 (n)

圖3 BTG1在膠質瘤及正常腦組織中表達的Western blot檢測結果 1：Ⅳ級膠質瘤；2：Ⅲ級膠質瘤；3、4：Ⅱ級膠質瘤；5、6、7、8：正常腦組織

圖4 PTEN在膠質瘤及正常腦組織中表達的Western blot檢測結果 1、2：Ⅱ級膠質瘤；3：Ⅲ級膠質瘤；4：Ⅳ級膠質瘤；5、6、7、8：正常腦組織

3 討論

膠質瘤具有病理形態學及遺傳學改變的復雜性特點，常侵犯周圍正常腦組織[8]，目前多數傳統治療方法無效，高級別腫瘤的病死率較顯著[9]。一些更廣泛的治療方法正處在進一步嘗試及評估中，包括免疫及基因治療，但這些方法還未被證明有效[10]，因此腦膠質瘤還需更廣泛的研究。

BTG1屬人類BTG/TOB的家族，至少包括6種不同成員，即BTG1、BTG2/PC3/Tis21、BTG3/Ana、BTG4/PC3B、TOB1和TOB2，參與細胞增殖及生長周期的調控，并介導多種細胞分化[11]。研究表明，BTG1基因對細胞增殖起負調控作用[12]。BTG1在癌組織中表達下降，如卵巢癌、食管癌、胃癌、肝細胞癌、甲狀腺癌、乳腺癌及肺癌等[3-7]，且其過表達抑制卵巢癌細胞的增殖、轉移、浸潤和凋亡[13]。以上研究證實BTG1是一種新的抑癌基因，但BTG1基因是否是腦膠質瘤相關抑制基因？在膠質瘤中的表達狀況如何？目前國內外尚未見文獻報道。

PTEN是位于人類10號染色體的一個抑癌基因，在腫瘤的發生發展中起至關重要的抑制作用，在多種腫瘤，如子宮內膜癌、前列腺癌、腎細胞癌、結腸癌及肺癌等中存在雜合缺失或突變[10，14-17]。有研究[18-20]表明，PTEN具有抑制腦膠質瘤生長的作用，并試圖通過抑制腦膠質瘤生長尋找新的治療靶點。

本研究首次應用免疫組化染色和Western blot技術對腦膠質瘤及正常腦組織中BTG1蛋白進行定位和定量檢測，并對PTEN進行檢測，結果顯示，BTG1和PTEN蛋白在腦膠質瘤組織中的表達水平均低于正常腦組織，且蛋白的表達水平與病理組織學分級有關。以上結果提示，BTG1和PTEN的缺失是腦膠質瘤發生發展的重要促使因素。研究進一步證實，腦膠質瘤組織中BTG1和PTEN的表達水平與病理組織學分級呈負相關，腫瘤級別越高其表達越少。BTG1對腦膠質瘤細胞的生長及凋亡等功能學研究將成為我們新階段的研究內容。

BTG/TOB家族作用機制的研究不多，Li等[21]提出BTG2可能通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信號通路而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。Chakravarti等[22]報道，PTEN基因的突變或缺失通常導致PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號網絡的激活，且與膠質瘤患者存活降低相關聯。PTEN蛋白劑量水平的變化也與腫瘤的發生發展密切相關[14，23]。Cheng等[24]研究提示，BTG3與PTEN功能極其相似，均是PI3K/AKT信號通路的負性調控因子和P53作用靶點，都對細胞周期檢測點激酶1產生影響。但BTG1與PTEN是否在膠質瘤中也具有此相似性尚未見報道，因此，本實驗對二者在腦膠質瘤的表達進行了相關性分析，結果顯示，二者在膠質瘤和正常腦組織中表達相似，呈正相關關系，且與膠質瘤分級呈負相關關系，與之前研究結果一致[24-25]。

綜上所述，腦膠質瘤較正常腦組織中BTG1和PTEN的表達率低，且與膠質瘤的組織學分級呈負相關，二者在膠質瘤的發生發展中發揮重要的作用，但其能否成為新的治療靶點有待進一步探討。

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(收稿2017-01-10)

The expression and influence of BTG1 in gliomas tissue

Han Xiaohui，Lian Yajun

Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

Objective To investigate the expressions of BTG1(human B cell translocation 1) and PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10) in gliomas tissue，and their relationships with glioma grade．Methods Immunohistochemical staining(EnVision method) was used to detect the expressions of BTG1 protein and PTEN protein in 80 cases with brain gliomas and 25 cases with normal brain tissue；Western blotting was used to test the expressions of BTG1 protein and PTEN protein in 4 cases with brain gliomas and 4 cases with normal brain tissue．Results The positive expression rates of BTG1 protein in brain gliomas and normal brain tissue were 73.8% and 96.0%，respectively，and the difference was statistically significant(P<0.05)．The expression of BTG1 protein in glioma tissue was negatively related to glioma grade(P<0.05)，but its expression had nothing to do with the patient’s sex and tumor size(P>0.05)．The positive rates of PTEN protein in brain gliomas and normal brain tissue were 77.5% and 100%，respectively．It also had a statistically significant difference(P<0.05)，and the expression of BTG1 protein in brain glioma tissue was negatively related to glioma grade(P<0.05)．Conclusion Both BTG1 protein and PTEN protein play important roles in the development of gliomas，which may provide additional reference for histology grade of glioma and may become new targets of gene therapy．

BTG1；PTEN；Glioma

R739.41

A

1673-5110(2017)08-0005-05