基于LC—MS技術毛細支氣管炎風熱閉肺證的代謝組學研究

陳超　邊遜

摘要：目的 采用高效液相色譜-質譜聯用技術的代謝組學方法，探析毛細支氣管炎中醫風熱閉肺證在血清內源性代謝物的變化，以尋找毛細支氣管炎中醫風熱閉肺證的診斷標志物。方法 收集毛細支氣管炎患兒風熱閉肺證（風熱閉肺組）20例和健康兒童（對照組）20例。以液相色譜-質譜聯用技術對兩組受試患兒的血清樣本進行代謝圖譜分析，并對潛在的生物標記物進行鑒定。結果 風熱閉肺組與正常對照組相比很多離子峰高、峰面積均存在著明顯差異，篩出具有統計學差異的差異生物標志物共8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。結論 本研究從代謝組學小分子水平初步反映了小兒毛細支氣管炎風熱閉肺證的代謝特征，為從生物代謝的角度研究中醫證候的現代科學內涵提供了一定的實驗依據。

關鍵詞：代謝組學；毛細支氣管炎；風熱閉肺證；液相色譜-質譜聯用技術

Study on Metabonomics of Bronchiolitis with Wind Heat Obstructing Lung Syndrome Based on LC-MS

CHEN Chao，BIAN Xun

（Department of Pediatrics，Nanjing Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

Abstract：Objective Using high performance liquid chromatography-mass spectrometry metabonomic technique study method，the change of capillary bronchitis chinese wind heat closed the lung in serum endogenous metabolites，to find the diagnosis of bronchiolitis in Traditional Chinese Medicine of wind heat closed lungs markers.Methods Capillary bronchitis in children with wind heat closed the lung（wind heat closed lung group）and 20 healthy children（control group）20 cases.The two groups of serum sample test were analyzed by using metabolic profiling by liquid chromatography mass spectrometry，and to identify potential biomarkers.Results Many group of wind heat lung ion peak high compared with the normal control group，area there were significant differences， with statistical difference between screening biomarkers were 8： L-valine， urea， L-aspartic acid， 2 of ammonia - imidazole，D-mannose，L-asparagine，D-fructose，L-glutamine.Conclusion This study from the metabonomics small molecular level preliminary reflect the metabolic characteristics of children with bronchiolitis in wind heat closed the lung，and provide a certain experimental basis for the modern scientific connotation of TCM syndromes from the perspective of biological metabolism.

Key words：Metabonomics；Bronchiolitis；Wind heat obstructing lung syndrome；Liquid chromatography-mass spectrometry

中醫證候代謝組學研究[1]是運用代謝組學相關技術對中醫不同證候患者或模型動物的血漿、尿液等樣本進行代謝產物分析，得到各自的代謝產物圖譜，篩查出特異性代謝產物的標志物，并用生物信息學方法分析生物標志物的功能，以確定“證相關代謝譜群”。本研究采用高效液相色譜-質譜聯用代謝組學技術對毛細支氣管炎風熱閉肺證患兒血清內源性小分子代謝物的變化差異進行分析，探析毛細支氣管炎中醫風熱閉肺證的代謝組學特征，以期為毛細支氣管炎中醫證候學研究提供代謝組學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 全部病例均來源于2012年2月～2014年4月我院兒科RSV毛細支氣管炎風熱閉肺證住院患兒，共20例。2014年3月～2015年10月健康體檢患兒20例。兩組在性別、年齡方面無統計學差異（P>0.05），簽署知情同意書。

1.2病例納入標準 西醫診斷參照全國高等學校教材《兒科學》（第七版），中醫疾病診斷、證候診斷參照普通高等教育“十五”國家級規劃教材、新世紀全國高等中醫藥院校規劃教材《中醫兒科學· 肺系疾病·肺炎喘嗽》及國家技術監督局發布《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語證候部分》的相關內容。排除應激和先天性心臟病、支氣管肺發育不良、早產及免疫缺陷等患兒。

1.3樣本采集及處理 根據知情同意書，于患兒入院第2 d，取清晨取清晨空腹時采集靜脈血5 ml，經13000 r/min離心10min。取血清，分裝，先置于-20℃，1 w后置-80℃保存；標本測試時將凍存的樣本在室溫下解凍，取50μL置離心管中，加入150 μL乙腈，渦旋充分混勻，然后16000 r/min，高速離心5 min，取上清液過Captiva ND Lipids過濾板，取濾液進樣、LC-MS儀分析。

1.4統計分析方法 在樣品測定時，用Agilent MassHunter Workstation軟件包中的Data Acquisition軟件進行數據采集，然后用Qualitative Analysis對獲得的數據進行分子特征識別，分析處理后，導入Mass Profiler Professional（MPP）軟件，通過MPP軟件處理數據，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法來描述數據內部的特征，運用PCA得分圖（Score plot）獲得樣本分類信息，并發現可作為生物標記物的化合物，在此基礎上用PLS-DA 進行建模，來考察生物標記物對于毛細支氣管炎中醫證候篩選的準確度和靈敏度，在多維統計中找出差異代謝物，并應用SPSS11.0統計軟件進行Kruskal-Wallis檢驗和單因素ANOVA分析的驗證，結合VIP值大于1并具有統計學意義（P<0.05）的代謝物確定為潛在標記物。

2 結果

2.1各組血漿液相色譜-質譜代謝輪廓分析 正常組、RSV感染喘息性支氣管炎風熱閉肺組（簡稱風熱閉肺證組）血液液相色譜-質譜聯用（LC-MS）典型總離子色譜圖（Total ion current chromatogram，TIC）見圖1、2，模式識別分析結果顯示在相同保留時間下風熱閉肺組與正常對照組相比很多離子峰高、峰面積存在著明顯差異。

2.2潛在標志物 采用LC-MS儀器自帶的相似匹配軟件結合保留時間，通過PCA法等分析，經SIMCA-P軟件分析并經過譜庫鑒定、分析得出毛細支氣管炎風熱閉肺證患兒相比健康對照組有統計學意義的差異表達血清代謝物有8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺，見表1。

3 討論

急性毛細支氣管炎是嬰幼兒時期臨床最為常見的呼吸系統疾病，臨床上以喘憋為特征，好發于3歲以內患兒，尤其是2月～6個月的嬰兒。Sihurs等研究發現[2-3]毛細支氣管炎反復發作易進展為哮喘，是兒童哮喘的風險因素之一，其確切機制目前尚不清楚。在治療方面，現代醫學尚無特效藥物，中醫根據辯證論治原則，組方配藥，臨床療效滿意，具有一定優勢，但目前中醫的證候學研究尚缺乏客觀量化標準。

機體代謝產物的變化可敏銳地反映機體在特定生理病理狀態下的變化，是組學研究的最終目標與方向，自2009年SlupskyCM[4]首次提出基于NMR的代謝組學研究方法可能適用于肺炎的病因快速診斷，在未來肺炎的醫學研究中具有明顯優勢，本研究采用LC-MS代謝組學技術分析患兒血漿代謝物發現，毛細支氣管炎風熱閉肺證患兒與健康對照組間在小分子代謝物表達水平具有明顯差異，共篩出具有統計學意義的差異性血清代謝物8種：L-纈氨酸，尿素，L-天門冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天門冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。表明在RSV感染的狀態下，患兒體內一些小分子代謝物的含量發生明顯改變，提示該代謝通路改變具有差異性。

本研究從代謝組學小分子水平初步反映了小兒毛細支氣管炎風熱閉肺證的代謝特征，為從生物代謝的角度研究中醫證候的現代科學內涵提供了一定的實驗依據，為今后中醫兒科證候學研究做出了有益探索。

參考文獻：

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[8]單傳松.活喘顆粒治療小兒毛細支氣管炎的臨床研究[D].山東中醫藥大學，2012.編輯/王朵梅